Proteomic study of light responses in Rhodospirillum centenum

Abstract

Fontosentetik mikroorganizmalar ısıgın dalga boyunu ve yogunlugunualgılayabilmektedir. Rhodospirillum centenum oksijensiz ortamda yetisebilen fotosentetik birbakteridir ve Ppr adlı hibrit ısık almacına sahiptir. Bu projenin amacı mavi ısıgın ve Ppr ısıkalmacının Rh. centenum üzerinde oynadıgı rolü proteomic açıdan belirlemektir. Metod: Dogalve Ppr reseptörü mutasyona ugratılmıs Rh. centenum susuları oksijensiz ortamda 48 saat37oC'de büyütüldü. Kültürlerden kontrol gurubu yanlızca kırmızı ısıga maruz bırakılırkenörnek çalısma gurubu kırmızı ısıga ilave olarak mavi ısıklı ortamda yetistirildi. Her birsusudan ayrı ayrı proteinler izole edildi ve kantitatif iki boyutlu jel elektroforezinde yürütüldü.Proten spotları kütle spektrometrisine uyumlu, yüksek hassasiyete sahip floresan boyamametodu kullanılarak tespit edildi. Protein sentez farklılıkları iki farklı normalizasyon metodutemel alınarak belirlendi. Bunlar FLIS ve Proteomweaver programının içerdigi PMBnormalizasyon metodlarıdır. Proteinlerin sentez farkları istatistiksel olarak analiz edildi.Analiz metodu olarak (olasılık degeri 0,05'ten küçük) Student' t-test kullanıldı. Sentez farkıbelirlenen proteinler yürütülmüs olan iki boyutlu jelden kesilerek alındı, proteinler guanidineedilip boy eve iyonlardan ayrıstırıldı. Triptik enzim ile muamele edilerek parçalananproteinler jel ortamından izole edildi. Elde edilen protein fragmanları ikiye bölündü ve aynıörneklerden olusturulan ilk gurup MALDI MS/MS analizinde kullanılmak için sülfonik asitile modifiye edildi. Modifiye edilmeyen gurup ise LC-MS/MS analizindekullanınldı.Ardından sentez farkı belirlenen proteinlerin triptik enzim ile kesilmis peptitfragmanlarına kütle spektrometri analizileri yapıldı ve sonuçlar uygulanan kütlespektrometrisini temel alan bilgi bankasının arama algoritmasına sahip Mascot analizprogramı kullanılarak tesbit edildi. Ayrıca MALDI MS/MS sonuçları de novo sekanslamayoluylan da belirlenmeye çalısıldı. Sonuç: Analizler sonucunda kütle spektrometri ölçümüneolanak saglayan hassaisyeti yüksek floresan boya ile boyanmıs olan her bir jel için yaklasık500 protein spotu belirlendi. Protein spotlarındaki farklılıklar görüntü analiz programıProteomweaver ve ardından istatistiksel analizler ile belirlendi. Ppr mutant sususu için PMBnormalizasyon metodu ile 90, FLIS normalizasyon metodu ile 35 protein spotunda sentezseviyesinin degistigi gözlemlendi. statistiksel olarak esik degeri standart sapma degerinin ikikatı alındıgında (2) PMB metodu için 19 spot (13 sentezde artma, 6 sentezde azalma) veFLIS metodu için 13 spot (6 sentezde artma, 7 sentezde azalma) geriye kalmıstır. Dogal susuiçin ise PMB normalizasyon metodu ile 72, FLIS normalizasyon metodu ile 138 proteinspotunda sentez seviyesinin degistigi gözlemlendi. statistiksel olarak güven aralıgı %95alındıgında PMB metodu için 10 spot (4 sentezde artma, 6 sentezde azalma) ve FLIS metoduiçin 13 spot (0 sentezde artma, 7 sentezde azalma) geriye kalmıstır. Her bir adım bizi yanlıspozitif sonuçtan uzaklastırarak daha güvenilir sentezinde farklılık olan proteinlerin listesiyapmamıza olanak saglamıstır. Sentez seviyesinde farklılık belirlenmis olan 32 proteinden 14tanesi üç farklı yol kullanılarak tespit edildi. Mascot programı MALDI ve LC-MS analizlerisonucunda elde edilen PMF ve PFF spectrogramlarını, de novo sekans yolu ise yanlızcaMALDI MS/MS analizi sonuçlarını kullanarak olusturulan peptit sekans dizilerini Rh.centenum'a ait birincil protein dizisi içinde tarayarak proteinlerin isimlendirildi. Nihai sonuç:Bu çalısma Rh. centenum proteomu hakkında ön bilgiler elde edilmesini saglayarak, ısıgınetkisi karsısında sentezinde degisim olan proteinlerin, belirlenmesinede katkıda bulunmustur.Anahtar Kelimeler: Proteomiks, Rhodospirillum centenum, fotosentez, Ppr ısık almacı, ikiboyutlu jel elektroforezi, MALDI MS7MS, LC-MS/MS, normalizasyon, sülfonik asitmodifikasyonu, guanidinasyon, de novo sekanslama.

Most photosynthetic microorganisms have the capability of sensing light of differentwave lengths and intensities. Rhodospirillum centenum is an anoxygenic photosyntheticbacterium that contains a hybrid photoreceptor protein called Ppr (PYP ? phytochromerelated). The objectives of this study were to determine the proteomic changes of Rh.centenum towards blue light intensities, and the physiological condition at which the Pprphotoreceptor best function. Method: A wild type (wt) Rh. centenum strain and a Ppr-deletionmutant (Ppr) strain were grown anaerobically for 48 hours at 37oC. The cultures wereexposed to continuous red and blue light exposure while the controls received no blue lightexposure. For each strain, the protein constituents were analyzed by quantitative twodimensionalgel electrophoresis. A fluorescent staining protocol was used to detecte proteinspots, which is sensitive and compatible with subsequent mass spectrometry. For comparison,two different normalization methods were applied based on (i) a fluorescently labeled internalprotein standard (FLIS) and (ii) the default normalization algorithm implemented in theProteomweaver analysis software (Pair Matched Based). Differentially expressed proteinswere detected with statistical analysis. Student?s t-test was applied for detecting statisticalsignificance (P value was set at <0.05). Differentially regulated protein spots were manuallyexcised. The proteins were guanidinated in-gel and desalted/destained. Subsequently, theguanidinated proteins were enzymatically cleaved with trypsin and, after extraction, one set ofthe peptides were sulfonated for MALDI MS/MS analysis. The other set of non-sulfonatedpeptides were used for LC-MS/MS analysis. Subsequent identification of differentiallyexpressed proteins was based on mass spectrometric (MS) analysis of tryptic peptides and theuse of MS-based database search algorithms (Mascot analysis software). Tandem MALDIresults were also subjected to manual de novo sequnencing. Results: Following computationalanalysis, we detected approximately 500 protein spots per gel using a fluorescent stainingprotocol. For Ppr strain, 90 spots were significantly detected after PMB-normalization and35 spots after FLIS-normalization. After setting a threshold of two times the SD (2) only 19significantly regulated spots (13 up, 6 down) remained for the PMB-normalized data and 13spots (6 up, 7 down) for the FLIS-normalized data. In the case of wt strain we detected 72significant spots for the PMB-normalized data and 138 spots for the FLIS-normalization.After setting a 95% confidence interval which accounts for experimental variation, only 10significantly regulated spots (4 up, 6 down) remained for the PMB-normalized data and 7spots (0 up, 7 down) after the FLIS-normalized data. Each step has ruled out more falsepositive spots and brought us closer to a true candidate list of significantly regulated spots. 14interpreted spots out of 32 differentially expressed significant spots were identified witheffective combination of three identification methods. Mascot analysis software was used tomatch for PMF and PFF results of MALDI and LC-MS, and partial de novo sequence oftandem MALDI results were used to match within the primary protein sequence informationof Rh. centenum. Conclusions: This study has generated a preliminary data on the proteomicsof Rh. centenum that has an important impact on unraveling of the regulatory proteinsinvolved in its photo responses.Keywords: Proteomics, Rhodospirillum centenum, photosynthesis, Ppr photoreceptor, twodimensionalgel electrophoresis, MALDI MS/MS, LC-MS/MS, normalization, sulfonation,guanidination, de novo sequencing.