Investigating the role of Cyclin dependent kinase 2 in triggering late G1 expression of stem loop binding protein as a major mechanism to regulate histone production

Abstract

Metazoan replication dependent histone mRNAs are the only eukaryotic cellular mRNAs that are not polyadenylated. Synthesis of mature histone mRNA requires only a single processing reaction: an endonucleolytic cleavage between a conserved stem-loop and a purine-rich downstream element to form the 3' end. The stem-loop binding protein (SLBP) is required for histone mRNA processing and involved in transport of the mRNA to the cytoplasm, where SLBP participates in translation of histone mRNA and regulation of histone mRNA stability. SLBP expression is limited to S phase and cell cycle regulation of SLBP is one of the major mechanisms that restricts histone mRNA metabolism and thus histone production to S phase.The level of SLBP is low during early G1 and dramatically increase as cells enter to S phase. It has been shown that low level of SLBP is due to low translational efficiency of SLBP mRNA and translation of SLBP increases as cells approach to S phase. High level of SLBP is maintained throughout the S phase and degraded at S/G2 border depending on phosphorylation of N-terminal SFTTP sequence. Another regulated degradation of SLBP was shown to be present at mid G1 phase, which keeps SLBP level low until the subsequent S phase. The molecular details of G1 regulation of SLBP needs to be elucidated further.In this dissertation, I have worked on investigating the G1 phase regulation of SLBP. In order to facilitate studies concerning the G1 regulation of SLBP, I have generated stable cells expressing wild type and `S/G2 degradation mutant' SLBP. The mutant form of SLBP will contribute for several factors including; determination of whether the degradation at late G1 phase is mediated via the same or distinct motif that is responsible for S/G2 degradation, bring with detectable amount of SLBP enabling the studies of SLBP regulation in G1 phase and eliminate the interference of S/G2 degradation with regulated degradation in G1/S transition.In the second part of my thesis, I have analyzed the role of Cdk2, the major player of G1/S transition, on SLBP expression. Asynchronous Hela cells treated with chemical inhibitor (Roscovitine) of Cdk1 and Cdk2 have decreased SLBP level. For specific inhibition of Cdk2, I have transfected Hela cells with Cdk2 dominant negative and analyzed that SLBP expression has dropped off in these cells. Further, in order to particularly examine the role of Cdk2 on rapid increment of SLBP at G1/S border, I have synchronized cells by distinct methods and treated them with Roscovitine at late G1 phase. Inhibition of Cdk2 activity at late G1 phase caused decrease in SLBP level. Thus, we have concluded that Cdk2 is required for SLBP expression and it triggers rapid increment of SLBP as cells approach to S phase.

Metazoan bağımlı histon mRNA ları poliadenillenmeyen tek ökaryotik hücre mRNA larıdır. Olgun histon mRNAlarının sentezi tek bir işlenme reaksiyonunu gereketirirler: 3? ucu oluşturmak için korunmuş stem-loop bölgesi ve pürince zengin downstream elementi arasında endonükleotik kesim. Stem-loop bağlanma proteini (SLBP) histone mRNA işlenme süreci ve devamında gereklidir. Histon mRNA sı SLBP eşliğinde sitoplazmaya taşınır, burada SLBP histon mRNA translasyonunda görev alır ve histon mRNA degredasyonunun düzenlenmesinden de sorumludur. SLBP ekspresyonunun S fazla sınırlanması ve SLBP nin hücre döngüsündeki düzenlenmesi, sonuç olarak histon mRNA metabolizmasını ve dolayısıyla histon üretimini S fazda sınırlandırır.SLBP seviyesi erken G1 da düşüktür ve hücre S faza girdiğinde ise önemli ölçüde bir artış meydana gelir. G1 fazının başlarında SLBP seviyesinin düşük olaması SLBP mRNAsının translasyon veriminin düşük olmasına bağlı olduğu ve bu verimin geç G1 fazına yakın bir yerde yükseldiği gösterilmiştir. Yüksek miktardaki SLBP S fazı boyunca devam eder ve S fazının sonunda N-uçta bulunan SFTTP dizisinin fosforilasyonuna bağlı olarak S faz sonunda parçalanır. Buna benzer bir tane daha düzenlenmiş degredasyon G1 fazının sonlarında gözlemlenmiştir. SLBP nin G1 fazındaki regülasyonunun moleküler detayları hala açıklığa kavuşturulmak için beklemektedir.Bu tez çalışmasında SLBP nin G1 fazındaki regülasyonu üzerinde çalıştım. İlk olarak SLBP G1 çalışmalarına imkan veren `S/G2 degredasyon? mutantının stabil hücre hattı oluşturulmuştur. Bu hücre hattı ile SLBP nin G1 fazındaki degredasyonunun S/G2 fazındaki degredasyondan bağımlı yada bağımsız olduğunu göstermek mümkün olacaktır.Tezin ikinci parçası olarak, G1/S geçişindeki ana faktör olan Cdk2nın SLBP ifadesine etkisi araştırılmıştır. Cdk1 ve Cdk2nun kimyasal inhibitörleri ile işlem görmüş asenkronize Hela hücrelerinde SLBP seviyesinde düşüş saptanmıştır. Bu düşüşün Cdk2 tarafından yapıldığını göstermek için hücreleri Cdk2 dominant negatifi ile transfekte etmiş ve aynı şekilde yine SLBP seviyesinde azalma gözlemlenmiştir. Bununla birlikte, Cdk2 nun SLBP nin G1/S gaçişindeki rolünün araştırılması için senkronize hücreler Roscovitine ile işlem görmişlerdir. G1 fazının sonlarında Cdk2 ifadesinin inhibe edilmesi ile SLBP seviyesinin düştüğü gösterişmiştir. Bütün bu sonuçları değerlendirerek, Cdk2 nun SLBP ifadesi için gerekli olduğunu ve SLBPnin G1/S sınırındaki hızlı artışını tetiklediği sonucuna varılmıştır.