A novel lateral flow test strip for the detection of CagA antigen of Helicobacter pylori in sera of infected subjects

Abstract

Dünya nüfusunun yarısının Helicobacter pylori ile enfekte olduğu çok iyi bilinmektedir. Bu enfeksiyonun teşhisi, enfekte vakaların milyonlarcasının şiddetli patolojik sonuçlardan muzdarip olduğu gerçeği kolaylıkla idrak edilemediğinden büyük bir güç sarfetmeyi gerektirir. CagA-pozitif suşları ciddi mukoza hasarına yol açıp mide ve duodenum ülserinde ve mide kanserinde risk faktörü olarak görev aldığından, CagA proteini H. pylori'nin önemli virülans faktörlerinden bir olarak kabul edilmektedir. Amacımız enfekte vakaların serumlarındaki serbest CagA proteininin kendisini belirlemek için altın bağlı monoklonal antikor kullanarak çift antikorlu sandiviç formatında bir lateral akım test çubuğu üretmek ve bu proteinin varlığıyla hastalığın derecesi ve klinik çıktısı arasındaki bağlantıyı bulmaya yardımcı olmak. Bunun için iki tane ticari mevcut anti-CagA monoklonal antikor kullanıldı. Bir tanesi positif reaksiyonda kırmızı rengi sağlamak için 20 nm altın nano parçacık ile konjuge edildi. Bu monoklonal antikorlar, bizim recombinant CagA proteinimiz üzerindeki epitopları tanıyıp tanımadığını tespit etmek için ilk olarak dot blot testinde değerlendirildi. Test çubuğu şu malzemelerden meydana gelmiştir: örnek pedi, konjugat pedi, membran ve emici ped. Testin optimizasyonu, altınla işaretlenebilmesi için monoklonal antikorların konsantrasyonlarını, antijenin konsantrasyonunu ve reaksiyonun hızını tespit etmek için membranın çeşidinin belirlenmesi ile sağlandı. Test çubuğu, rekombinant CagA proteini ilave edilmiş serum örnekleri test edilerek değerlendirildi. CagA proteinin birkaç konsantrasyonu test edildi ve kırmızı rengi veren minimum konsantrasyon 4 µg/ml olarak bulundu. Kontrol çizgisi test çubuğunun iyi bir şekilde çalıştığını doğrulayan kırmızı renk olarak her zaman göründü. Test çubuğu, diğer bakteri antijenleri ya da serum proteinleri ile çapraz reaksiyon veya engellenme göstermedi.Anahtar Kelimeler: Helicobacter pylori, Lateral akım test çubuğu, CagA

It is well known that half of the world populations are infected with Helicobacter pylori. The diagnosis of such infection exerts a big burden that is not easy to handle taking into considerations that millions of infected subjects suffer from severe pathological outcome. The CagA protein is considered to be one of the key virulence factors of H. pylori, since CagA-positive strains provoke severe mucosal damages and act as a risk factor for the development of peptic ulceration and gastric cancer. Our aim is to develop a lateral flow test strip based on double-antibody sandwich format using gold conjugated monoclonal antibody to detect the free CagA protein of H. pylori in sera of infected subjects and to correlate the presence of such protein with the severity of the disease and the clinical outcome. Two commercially available anti-CagA monoclonal antibodies were used. One was conjugated with a 20 nm gold nanoparticle to provide red color in positive reaction. These monoclonal antibodies were first evaluated in a dot blot test whether or not they will recognize the epitopes on our recombinant CagA protein then used in the test strip. The test strip was assembled from the following materials: sample pad, conjugate pad, membrane and absorbent pad. Optimization of the test was conducted to determine the concentration of monoclonal antibodies to be used for gold labeling, the concentration of the antigen and the type of the membrane to determine the speed of the reaction. The test strip was evaluated by testing serum samples supplemented with recombinant CagA protein. Several concentrations of the CagA protein were tested and the minimum concentration that gave a red color was 4 µg/ml. The control line always appeared red in color which confirms the proper working of the test strip. The test strip showed no cross-reactivity or interference with other bacterial antigens or serum proteins.Keywords: Helicobacter pylori, Lateral flow test strip, CagA