Alzheimer hastalığı ile DNA topoizomeraz`nın primer nöron hücrelerinde ilişkilendirilmesi

Abstract

Memeli hücrelerinde DNA topoizomeraz IIß?nın (topo IIß) in vivo fonksiyonu hala netlik kazanmamakla beraber son yıllarda, topo IIß?nın gen ifadesinin tetiklenmesi, başlatılması esnasında önemli bir enzim olduğu rapor edilmektedir. Topo IIß aktivitesinin hem in vitro ve hem de in vivo durdurulması, nöronal hücre farklılaşması ile ilgili bazı genleri baskılayarak akson kısalmasına ve DNA hasarında artmaya neden olduğu bilinmektedir. Bu çalışmalar topo IIß?nın aksonogenezde rol oynadığını ve DNA tamir mekanizmalarında gerekli önemli bir enzim olduğunu göstermektedir. Ancak, topo IIß?nın akson oluşumunu ya da gelişimini hangi yol ile kontrol ettiği bilinmemektedir. Ayrıca, nörodejeneratif hastalıklardan Alzheimer Hastalığı?nda görülen akson kısalması, DNA hasarının artması gibi birden fazla belirtilerin olması, bir çok geni kontrol edebilen topo IIß geninin ifadesindeki artma/azalmalar veya enzimle alakalı başka anormallikler sonucu yaşanabileceğini düşündürmektedir. Şu ana kadar yapılan çalışmalarda topo IIß?nın bu hastalık oluşumu ya da gelişimiyle ilgisine dair bir veri bulunmamaktadır.Bu çalışmada, Alzheimer Hastalığı?nda görülen problemlerin topo IIß?ya bağlı gerçekleşebileceği sıçan primer hücre kültüründe araştırmıştır. Bu amaçla, primer serebellar granül hücreler 9 günlük sıçanlardan uygun methodlarla ayrıştırılmış, büyütülmüş ve yaşatılmıştır. Morfolojik olarak sağlıklı olduklarına inandığımız nöral bağlantıların, nöral belirteç ifade düzeylerini western blot ve onların lokalizasyonlarını immunfloresan teknikleri ile teyit ettik. Daha sonra, in vitro Alzheimer hastalığı modeli yapmak için amyloid beta 1-42 peptidi 370C? de 24 ve 48 saat karıştırıcı eşliğinde fibril hale getirilmiştir. Bu fibriller primer nöron kültürüne hücrelerin dördüncü gününde verilip hücreler bir gece maruz bırakılmıştır. Ertesi gün fibril oluşumunun başarısınıvölçmek adına amyloid plaklar Congo kırmızısı ve amyloid beta 1-42 antikoru ile keşfedilmiştir. Dahası, bu fibrillerin toksisiteleri gerçek zamanlı hücre analizi sistemi (RTCA) (Roche) yardımı ile hücrelerin in vitro ortamda ilk günlerinden ve dördüncü günlerinde aldıkları fibriller dahil bir hafta süre boyunca izlenmiştir. Aynı zamanda nöron olmayan hücrelerin büyümesini durduran cytosine arabinoside (AraC) inhibitörünün toksisitesi yine aynı sistem üzerinden bir hafta boyunca takip edilmiştir. Son olarak topo IIß?nın Alzheimer hastalığı ile ilişkilendirilmesi adına, 24 ve 48 saat 370C?de inkübe edilmiş amyloid beta fibrillerinin verildiği ve bir gün süreyle maruz bırakıldığı hücrelerden protein örnekleri toplanıp western blot yöntemi ile topo IIß?nın ifade seviyesi karşılaştırılmıştır.Sonuç olarak, başarılı bir primer nöron kültürünün morfolojik olarak izlenmesinin ardından Neurofilament (NF-L) ve Tau gibi nöral belirteçlerin ifade düzeylerinin negatif nöral belirteç Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)?ye oranla daha yüksek çıkması bizi primer nöron kültürünün standardize edildiğine kanaat ettirdi. Ayrıca RTCA sonuçlarından elde edilen büyüme eğrisi 10000 hücrenin 96 kuyucuk plaklarında yaşamasının ideal olduğunu gösterdi. Başarılı bir primer nöron kültürü eldesinin ardından, in vitro Alzheimer hastalığı girişiminde, nöronlar arasında dışarıdan verdiğimiz amyloid beta plaklarının varlığı umut vaad edici sonuçlardı. Bu çalışmanın son ve en önemli bir deneyi olarak yaptığımız western blot teknikleriyle amyloid beta fibrillerine bir gece maruz kalmış primer nöron hücrelerinde topo IIß?nın ifade seviyesinin 48 saatlik ön inkübe edilmiş amyloid fibrillerin verildiği hücrelerde 24 saatlik olanlara gore daha az ekspres olduğunu gözlemledik. Diğer yandan da Tau proteinin topo IIß?ya tam ters şekilde ifade profile göstermesi beklediğimiz bir sonuç olarak karşımıza çıktı. Fosforile Tau ifadesiyle Alzheimer modeli oluşturduğumuza bir kanıt daha koyarken topo IIß?nun buna bağlı azalan ifade düzeyi Alzheimer hastalığı ile topo IIß?nın nörotoksik bir ilişki içinde olduğu ispatladık.Anahtar Kelimeler: DNA topoizomeraz IIß, Alzheimer Hastalığı, Aksonogenez, Amyloid Beta 1-42 Peptidi, Primer Nöron Kültürü, Serebellar Granül Hücreler.

In mammalian cells, DNA topoisomerase IIß (topo IIß) plays an important role in the initiation of selective gene transcription, neuronal differentiation and axonogenesis. Inhibition of topo IIß activity both in vivo and in vitro results in shorter axon length and increase of DNA damage by suppressing the transcriptional induction of differentiation- related genes. However, in which pathways of axonogenesis controlled by topo IIß has not been clarified yet. Additionally, the observed symptoms of Alzheimer`s disease such as axon shortening and increase in DNA damage give rise to thoughts about the abnormalities in the expression of topo IIß or aberration of the enzyme in different levels. However, there is no outcome related to the effect of topo IIß in the course of Alzheimer`s Disease (AD).In this study, it was studied that whether or not the symptoms of Alzheimer`s disease associates with the function of topo IIß in rat primary neuronal cell culture. For this purpose, rat cerebellar granule neurons from post-natal 9 days (P9) old rats were firstly isolated and cultured. In order to verify the establishment of the healthy primary neuronal culture, neuronal markers expression and localization were examined via western blot and immunofluorescence techniques, respectively. Then, amyloid beta (Aß) 1-42 peptide fibrils were synthesized by the incubation of Aß 1-42 peptide monomers at 370C during 24 and 48 hours, separately while shaking. These fibrils were given to primary neuronal culture on the 4th day in vitro (DIV). To confirm the success of the establishment of in vitro, immunofluorescence and Congo red staining were performed. Moreover, toxicity of Aß fibrils given to primary neuronal culture on 4th DIV was observed through Real Time Cell Analysis (RTCA) system during a week. At the same time, toxicity of cytosine arabinoside (AraC) was also examined on primary neuronal culture again via RTCA. As a final step, in order to associate the function ofiiitopo IIß with AD, samples collected from primary neuronal culture were applied to western blot technique upon Aß fibrils exposure to the cells during a day.According to the results, primary neuronal culture were established. Healthy and good connections between neurons in the culture was observed morphologically. From the western blot results, Neurofilament (NF) and TAU as neuronal markers were in dominance compared to Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) which is negative control of the presence of neurons in the culture. The results of immunofluorescence are also consistent with the western blot ones confirming the localization of these neuronal markers presence in the culture. From the RTCA results, the growth curve was obtained and determined that 10000 cells per 96 well plate is enough. Moreover, 10 ?M of AraC was an adequate concentration to stop the division of non-neuronal cell division in the culture. To evidence establishment of in vitro AD, amyloid beta plaques around neurons were detected both by Aß 1-42 antibody and Congo red stain. Besides these, the choice for the concentration of Aß 1-42 fibril as 7 ?M might have been not enough to be neurotoxic to cerebellar granule cells. It would be better to prefer 14 or 28 ?M and 48 hours exposure of Aß 1-42 peptides to primary neuronal culture rather than one day exposure.From this aspect, the prospective contributions of topo IIß to the diagnosis and treatment of Alzheimer`s disease will be defined.Keywords: DNA topoisomerase IIß, Alzheimer`s Disease, Axonogenesis, Amyloid beta 1-42 Peptide, Rat Primary Neuronal Cell Culture, Cerebellar Granule