Saturation mutagenesis of Toluene/o-Xylene Monooxygenase at alpha subunit residues F176, F196 and Q204 for the regiospecific hydroxylation of aromatics

Abstract

Toluen/o-ksilen monooksijenaz (ToMO) (EC: 1.14.13), sübstitue benzenleri de içeren geniş bir substrat yelpazesine sahip, çok-komponentli, hem-içermeyen, çift demirli bir enzimdir. Bu enzim, organik kirleticilerin biyoremediasyonu ve endüstriyel açıdan değerli olan kimyasalların sentezi için katalitik potansiyellere sahiptir. Bu çalışmada, ToMO hidroksilaz komponentinin F176, F196 ve Q204 pozisyonlarına katalitik aktivite ve regiospesifiklik üzerindeki etkilerini araştırmak amacıyla bölge saturasyon mutagenezi uygulandı. Bölge saturasyon mutagenezi ?overlap-extension PCR? yöntemiyle gerçekleştirildi ve mutantlar hızlı bir agar-plak yöntemi ile tarandı. Elde edilen mutantlar ile fenol, toluen ve naftalin üzerinde tüm-hücre biyodönüşüm deneyleri yapıldı. Ürünler, yüksek basınç sıvı kromatografisi ile analiz edildi. Bu çalışma sonucunda, TouA F176 pozisyonu için iki yeni regiospesifik mutant (F176N ve F176H) elde edildi. TouA F176N mutantı, fenolden % 77 hidrokinon ve toluenden % 92 p-kresol elde ederek en regiospesifik mutant olarak tespit edildi. TouA F176H mutantı test edilen substratlar için aktivite artışı gösterdi. Örneğin, TouA F176H fenolden hidroksifenolleri yapan-tip ToMO'ya kıyasla 5 kat daha hızlı üretti (5.84 ve 1.17 nmol / dk ? mg protein). Ayrıca, TouA F196 ve Q204 mutantlarından bazılarında küçük regiospesifik değişiklikler bulundu. Örneğin, wild-type enzime kıyaslandığında, TouA F196I mutantının, toluenden iki kat daha az o-kresol ve % 19 daha fazla p-kresol ürettiği, TouA Q204A mutantının ise naftalinden % 6 daha fazla 1-naftol ürettiği tespit edildi.

Toluene/o-xylene monooxygenase (ToMO) (EC: 1.14.13) is a multicomponent non-heme diiron enzyme with a broad substrate range of aromatics, including substituted benzenes. It has catalytic potentials for bioremediation of organic pollutants and synthesis of industrially valuable chemicals. In this study F176, F196 and Q204 positions of ToMO hydroxylase component (TouA) were subjected to site-saturation mutagenesis to investigate their roles in catalytic activity and oxidation regiospecificity. Site-saturation mutagenesis was achieved by overlap-extension PCR method and the mutants were screened using a rapid agar-plate assay. The isolated mutants were assayed by whole-cell biotransformation of phenol, toluene and naphthalene. Products were analyzed via high-pressure liquid chromatography. This study yielded two new regiospecific mutants of TouA F176 (F176N and F176H). TouA F176N variant was the most regiospecific mutant for hydroquinone formation (77%) from phenol and p-cresol formation (92%) from toluene. TouA F176H variant was also found to be an improved mutant for the tested substrates. For example, TouA F176H produces hydroxyphenol(s) 5-fold faster than wild-type ToMO (5.84 and 1.17 nmol/min ? mg protein) from phenol. In addition, slight changes in regiospecificity were found among variants of TouA F196 and Q204. For example, TouA F196I variant produced 2-fold less o-cresol and 19% more p-cresol from toluene, and TouA Q204A variant produced 6% more 1-naphthol from naphthalene compared to wild-type ToMO.