Development of a fast simple profiling methodfor sample screening using HRM of Y-STRs

Abstract

İnsan DNA'sının çok az bir kısmı (%0.03) bireyler arası farklılık göstermektedir. Bu değişken kısımların genom içindeki spesifik alanlardaki konumları ve özellikleri belirlenebilir ve bu belirteçler insan identifikasyonu için kullanılabilirler. Bu polymorfizmler iki grupta sınıflandırılırlar; sekans ve uzunluk polymorphizmleri. Bu tezde kullanılan STR belirteçleri uzunluğu belirli bir lokustaki nukleotid tekrarlarının sayısına göre değişen uzunluk polymorfizmleridir. STRlar adli tıp, popülasyon genetiği ve genetik soy bilim çalışmalarında sıklıkla kullanılmaktadır. STR haplotipleme ağırlıklı olarak yoğun iş gücü gerektiren ve zaman alıcı olan jel bazlı kapiler elektroforez yöntemleri ile gerçekleştirilir.Bu çalışmada, Y-STR erkek haplotiplerini ayırt etmek için bir tarama aracı olarak, HRM yöntemi geliştirdi. 12 akraba olmayan erkek birey, yaygın biçimde kullanılan Y-kromozomuna özgü 9 STR lokusunun (DYS19, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS437, DYS438, DYS439, and DYS448) varyasyonu açısından taranmıştır. Bu 9-Y-STR lokusu EVA yeşil boya varlığında spesifik primerler ile amplifiye edilmiş ve daha sonra HRM analizi, gerçek zamanlı PZR cihazı, Bio-Rad CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System gerçekleştirilmiş ve yöntemin tekrarlanabilirliği için QIAGEN Rotor-Gene™ 6000 cihazı ile tekrarlanmıştır. Dört lokusun: DYS393, DYS390, DYS439 ve DYS448, farklı haplotipleri HRM analizi ile ayırt edilmiştir. Bu lokusların cinsiyet tayin edici lokuslar olarak HRM taraması için önceden çalışılmış olan STRlar listesine eklenebileceği gösterilmiştir

Very small amount of human DNA (approximately 0.03%) differs between individuals. These variable markers are being located and characterized at the specific sites in the genome and used for human identification. The polymorphisms are classified in two groups; sequence and length polymorphisms. STR markers we use in this thesis are length polymorphisms which vary based on the number of nucleotide repetitions within a particular locus. STRs have been frequently used in forensics, population genetics, and genetic genealogy. STR haplotyping is mainly done by gel based and capillary electrophoresis methods which are labor intensive and time consuming. In this study we developed HRM method as a screening tool to discriminate Y-STR male haplotypes.12 unrelated male individuals were screened for variation at 9 commonly used Y-chromosome specific STR loci (DYS19, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS437, DYS438, DYS439, and DYS448). The 9 Y-STR loci were amplified with their specific primers in the presence of EVA Green dye, and then the HRM analysis was performed in a real-time PCR device Bio-Rad CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System and for reproducibility repeated with a second instrument QIAGEN Rotor-Gene™ 6000.Different haplotypes of the four loci DYS393, DYS390, DYS439, and DYS 448 were distinguished by HRM analysis. These loci can be added to the list of STRs that had been studied for HRM screening as sex determining loci.