Kırım Kongo kanamalı ateş virüsü antijenik nükleoprotein üretilmesi ve sitotoksik etkilerinin araştırılması

Abstract

Kırım-Kongo Kanamalı Ateş (KKKA) hastalığı keneler yoluyla bulaşan; hemorajik ve toksik etkilerle %30 ölüm riski taşıyan virütük bir hastalıktır. Ülkemizde KKKA hastalığı ilk defa 2002 yılında rapor edilmiş ve 2012 yılına kadar 7072 kişi bu hastalığa yakalanmış ve 356 kişi hayatını kaybetmiştir. KKKA hastalığını önleyici aşı ve hastalığı tedavi eden yaygın bir yöntem dünyada henüz yoktur. Ancak yapılan bilimsel araştırmalar sonucunda KKKA virüsünün genetik yapısı ortaya çıkarılmıştır. Literatürde bakteri aracılığıyla üretilen nükleoprotein (NP)'nin KKKA hasta serumlarındaki IgG ve IgM'i tanıdığı ve antijenik özellikte olduğu gösterilmiştir. Bizim amacımız da KKKA virüsünün antijenik nükleoprotein (NP)' nin rekombinant yolla elde edilmesi ve bu rekombinant proteinin hücre kültüründe toksisite testlerini yaparak güvenilirliğinin araştırılmasıdır. NP proteinini elde etmek için; ilk olarak NP geni GST vektörüne klonlanarak sekanslamaya gönderildi. Sekanslamada doğrulanan plazmid E.coli'nin BL21(DE)3 suşuna transform edildi. Transformasyon sonrası, IPTG aracılığıyla, protein ekspresyonu sağlandı ve 80 kDa ağırlığındaki GST-NP proteinini saflaştırmak için `native` protein purifikasyonu metoduna başvuruldu. Yapılan yöntemden sonuç alınamayınca, bu kez NP geni C-terminal His tag vektörüne klonlandı. Sekanslamada doğrulanan yeni plasmid aktarılarak IPTG aracılığıyla protein eksprese edildi ve 55 kDa ağırlığındaki His-Tag NP proteinini elde etmek için native ve denatüre olmak üzere iki farklı protein purifikasyon metotu uygulandı. Denatüre protein purifikasyonu metotuyla protein başarılı bir şekilde elde edildi. 55 kDa ağırlığında olduğu bilinen NP His-Tag füzyon proteinin doğruluğu için western blot yöntemi uygulandı. rNP'nin toksisitesi MTT ve endotoksin metotları yardımıyla ölçüldü. Elde edilen verilere göre; yaptığımız çalışmada rNP'nin toksisite miktarının düşük olması, NP proteinin aşı çalışmalarında kullanılabileceğini göstermektedir.Ayrıca bu çalışmada NP proteininin laboratuvar koşullarında, düşük maliyetli, güvenilir ve sınırsız miktarda üretilebileceği ispatlanmıştır. Bu çalışmanın sonucu, rekombinant NP'nin önce hayvan çalışmaları ve sonrasında aşı amaçlı kullanımının uygunluğu hakkında bilgi vermektedir.

Crimean-Congo Hemorrhagic Fever (CCHF) is a viral disease transmitted by ticks and CCHF virus causes a hemorrhagic and toxic syndrome in humans with mortality rates of up to 30%. CCHF disease has been reported in 2002 for the first time in our country, and 7,072 cases were reported and 356 people died until 2012. The preventive vaccines and treatment methods of CCHF disease are not yet available in the world. However, the complete sequence of viral genome of CCHF virus have been generated, and these efforts accelerated the research on the production of potential antigenic proteins and monoclonal antibodies. Recently, it has been shown that nucleoprotein (NP) of CCHF virus has antigenic properties by recognizing IgG and IgM in serum of CCHF patients. In this study, our aim is that to produce antigenic nucleoprotein (NP) by recombinant technology and to examine the safety of this recombinant protein by cytotoxicity tests in cell culture. First of all; NP gene was cloned into the GST vector and it was send to sequence and validate. After sequence validation, new plasmid was transformed in E.coli BL21(DE)3 strain and the native protein purification method was used to GST-NP protein that had 80 kDA molecular weight. When the experiment did not work, NP gene was cloned into His-Tag vector and product was sent to sequence and validate. Next, new plasmid was transformed in E.coli BL21(DE)3 strain. The native protein purification and denature protein purification methods were used to His-Tagged NP protein that had 55 kDA molecular weight. NP protein was got successfully with denature method. Next, westen blot was done to confirm molecular weight of His-tag NP protein. Afterwards toxicity of rNP was measured by endotoxin and MTT assays. According to our results, NP protein can be used in vaccine studies, because of low toxicity level of rNP. Additionally, it was proved that NP protein is cheap, reliable and highly producible. New products of this study will give information.about the appropriateness of recombinant NP to be studied in vivo and further in therapeutic purposes