Deınococcus radiodurans`ın hücre içi pH homeostasisinde görevli bazı genlerinin ifade düzeylerine gama ışını ve pH etkisinin RT-QPCR yöntemi ile incelenmesi

Abstract

D. radiodurans spor oluşturmayan, hareketsiz, küresel yapılı, aerob ve gram-pozitif bir bakteridir. Dünya'nın radyasyona en dayanıklı oksijenli solunum yapan canlısı olarak Guiness rekorlar kitabına giren D. radiodurans, iyonize radyasyonun yanı sıra; düşük nem, UV-C ışınları, yüksek konsantrasyonda reaktif oksijen türevleri ve mitomisin C gibi genotoksik ajanlara da direnç gösterebilmektedir.Tez çalışmasında D. radiodurans'ın farklı pH şartlarında inkübasyon ve radyasyon uygulamasıyla pH regülasyonunda rolü olduğu düşünülen bazı genlerinin etkinliği RT-qPCR yöntemi ile incelenmiştir. Çalışmada referans geni olarak gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz kullanılmıştır. Araştırmada, β-karbonik anhidraz, hidrojenaz (HypA ve HypB genleri), H+/Na+-glutamat simport membran kanal proteini, katyon değiştirici membran kanal proteini, arginin dekarboksilaz, glutamat sentaz büyük altbirimi, V-tip ATP sentaz altbirim-C, sitokrom C oksidaz altbirim-I, süksinat dehidrogenaz sitokrom altbirimi, NADH dehidrogenaz altbirim-B ve üreaz yardımcı protein (UreE ve UreG genleri) genlerinin ifade düzeyleri incelenmiştir. Ayrıca D. radiodurans'ın farklı pH'larda ki besiyerlerinde pH regülasyonunu nasıl gerçekleştirdiğini pH-duyarlı bir prob olan pHrodo® floresan boyası yardımıyla floresan ışık mikroskobu kullanılarak incelenmiştir.Yapılan denemelerde, farklı pH'larda inkübe edildiğinde farklı zamanlarda, izlenen bazı genlerin ifade düzeylerinde anlamlı değişimler belirlendi. Radyasyon uygulanan kültürlerde en yüksek ifade düzeyi 884,65 kat değişimle UreE geninde tespit edilmiştir. Ayrıca V-tip ATPaz'da referans genine göre ifade düzeyinin 546,33 kat arttığı belirlenmiştir.

D. radiodurans is a non-spore forming, non-motile, spherical shaped, aerobic and gram-positive bacteria. D. radiodurans, which entered into the Guiness records book as the world's most resistant aerobic organism to radiation also resistant to low moisture, UV-C rays, high amounts of reactive oxygen species, and genotoxic agents such as mitomycin C.In the thesis study, the efficacy of D. radiodurans genes thought to play a role in pH regulation in response to incubation and radiation application of different pH conditions was examined by RT-qPCR method. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene was used as reference gene in the study. In the research, expression levels of β-carbonic anhydrase, hydrogenase (HypA and HypB genes), H+/Na+ -glutamate symport membrane channel protein, cation exchange membrane channel protein, arginine decarboxylase, glutamate synthase major subunit, V-type ATP synthase subunit-C, succinate dehydrogenase cytochrome subunit, NADH dehydrogenase subunit-B, and urease accessory protein (UreE and UreG) genes were examined. In addition, how D. radiodurans performed in pH regulation in different pHs mediums was examined by using fluorescence light microscopy with a pH-sensitive probe, pHrodo® fluorescent dye.Significant changes in expression levels of certain genes were observed at different times when incubated at different pHs. The highest expression level fold, 884,65-fold was detected in the UreE gene treated with radiation culture. It was also found that the V-type ATPase level 546,33-fold more compared to the reference gene.