İnsan URG-4 (Up-Regulated Gene 4) geninin transkripsiyonel regülasyonu

Abstract

Up-regulated gene 4 (URG-4) geni, ilk olarak HBxAG proteinin doğal regülatörü olarak bulunmuştur. Sitokinlerle regülasyonu ve transkripsiyonel aktivitesi ile ilgili literatürde herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. URG-4 geninin transkripsiyonel aktivitenin belirlenmesi için, yaklaşık 530 bç'lik (-482/+63) ve minumum transkripsiyonel aktivitenin belirlenmesi için, kısaltılarak yapılmış promotor parçalar (-109/+63, -261/+63, -344/+63) PCR'a dayalı GC zengin stratejiler uygulanarak çoğaltıldı ve pMetLuc lusiferaz haberci vektör içerisine klonlandı. 530 bç lik promotor bölgesi NCBI gen bankasına kayıt edildi. Promotor bölgesinin TATA kutusu içermediği ve % 80 GC zengin bir bölge olduğu belirlendi. Transkripsiyon faktörü (TF) bağlanma motifleri incelendiğinde özellikle SP1 gibi çok sayıda TF bağlanma bölgesi içerdiği tespit edilmiştir.Transkripsiyonel aktivite için, URG-4 promotor parçaları, kalsiyum fosfat tekniği ile insan Karaciğer Kanser Hücre hattına (Hep3B) geçiçi transfeksiyon metodu kullanılarak aktarıldı. -109/+63 promotor parçasının bazal aktivitesinin en yüksek olduğu bulundu. Ayrıca kotransfeksiyon çalışmaları, hSP1 ve hUSF transkripsiyon faktörlerinin URG-4 promotorunun transkripsiyonel aktivitesini arttırdığı tespit edildi. DNA-protein etkileşim (EMSA) deneyleri, SP1 TF'nün -121/-159 bölgesine bağlandığını göstermiştir ve spesifik yarışma ve antikor süpershift deneyleri SP1'in bağlanmasını doğrulanmıştır. RT- PCR deneyleri SP1 aşırı ifadesinin URG4 mRNA'sını arttırdığı da tespit edilmiştir. URG-4 geni ve sitokinlerle ilişkisini aydınlatmak için, TGF-β ve TNF-α seçildi. Sitokinlerin etkisi hem mRNA hem de protein seviyesinde gösterildi. TGF-β sitokinin erken saatlerde URG-4 geninin ekspresyonunu mRNA ve protein seviyesinde arttırdığı ve TNF-α sitokininin ise 200Ü/mL doz uygulandığında arttırıcı etkisi olduğu görüldü. Aynı arttırıcı etki hepatoma olmayan yan model olarak seçilen prostat kanseri (PC3) hücrelerinde de tespit edildi. Yolak çalışmaları sonucunda TGF-β sitokinin MAPK/ERK yolağı üzerinden URG-4 genini etkilediği, TNF-α sitokininin ise JNK yolağıyla bağlantılı olduğu bulundu. URG-4 Varyant-1 cDNA'sı pCDNA3.2 vektörüne PCR'a dayalı bir teknikle klonlandı. Boş ve URG-4 genini içeren pCDNA3.2 vektörleri geçici olarak Hep3B, kalıcı olarak da Saos-2 hücrelerine transfeksiyonu yapıldı. Genin ektopik ifadesi RT-PCR, qPCR ve western metodları ile doğrulandı. Ayrıca, MTT deneyi ile, genin aşırı ifadesinin hücre proliferasyonuna arttırdığı belirlendi. Koloni formasyon deneyleri sonucunda, hücrelerin koloni oluşturma yeteneğini arttırdığı tespit edildi.

URG-4 gene was firstly found as a natural effector of HBxAG protein. There is no information about regulation by cytokines or promoter activity of URG-4 gene. To determine transcriptional activity of URG-4 gene, 530 bp (-482/+63) promotor site of URG-4 gene and truncated deletion constructs were amplified using PCR methods with GC-rich strategies. Then cloned into pMetLuc Lusiferase reporter vector. -482/+63 promoter construct of URG-4 gene was submitted to NCBI data bank. URG-4 promoter is TATAless promoter and contains 80% GC rich seqeunce. Transcription factor binding motifs analysis show the promoter contains many putative SP1 binding sites. For the basal promoter activity, URG-4 promoter constructs were transient transfected by Ca phosphate transfection methods into the Hep3B (Human Hepatoma) cells. -109/+63 URG-4 promotor construct showed the highest transcriptional activity. In addition, cotransfection analysis showed that hSP1 and hUSF upregulate URG-4 promoter constructs. DNA-protein interaction assay (EMSA) shows that SP1 transcription Factor is able to bind to URG-4 promoter sites, -121/-159. Spesific competition assays and antibody supershift assays confirmes the binding of SP1 in to the promoter. RT- PCR also indicates over expression of SP1 upregulates URG4 mRNA expression level in Hep3B cells. To elucidate the effect of cytokines on URG-4 gene expression, cancer related TGF-β and inflamation related TNF-α were chosen. The effects of cytokines on mRNA and protein levels of URG-4 gene were studied. Our results indicated that TGF-β cyctokine effected URG-4 gene and 200 U/mL dose TNF-α showed upregulation of URG-4 gene expression both mRNA and protein level. The same increasing effect was determined in another cell type model, PC-3, prostate cancer cells. According to Pathway inhibitory assay, it was found that TGF-β upregulates URG-4 gene through MAPK/ERK pathway and TNF-α effected by using JNK pathway. Full lenght of URG-4 Variant-1 cDNA was cloned by PCR based approach into pCDNA3.2 eucaryotic expression vector. Expression plasmid that contains URG-4 gene were transient transfected to Hep3B and stable transfected into Saos-2 cells URG-4 expression level was confirmed by using RT-PCR, qPCR and western method. In addition, MTT and colony Forming assays, it was determined that the ectopic expression of URG-4 gene induces proliferative effects of cells.