Proteozom inhibitörü MG-132`nin kanser hücre dizilerine etkisi

Abstract

Bu çalışmada, günümüzde kanser tedavisi için anti-kanser ilaçlarının bir alternatifi olarak kullanılan 26S proteozom inhibitörlerinden MG-132'nin kanser hücre dizileri üzerindeki morfolojik etkileri ve proteozom inhibisyonun neden olduğu eIF2? fosforilasyonunda Hsp70 proteinin bir rolü olup-olmadığı araştırılmıştır. Çalışmamızda 4T1 meme ve B16F10 melenoma kanser hücrelerine farklı sürelerde %0.1 DMSO (kontrol) veya 50 µM proteozom inhibitörü MG132 verildiğinde özellikle 8. saatten itibaren kontrol grubu dışındaki hücrelerde apoptozise benzer morfolojik değişimler gözlenmiştir. Hücrelerin küreselleşmesi, büzülüp küçülmesi ve membranda apoptotik veziküllerin oluşması bu tür hücre ölümünün karakteristik özellikleridir. Ayrıca, hücre ölümünü tespit etmek için hücrelere 24 saat süreyle %0.1 DMSO veya 10 µM MG-132 verilerek tripan mavisi testi ile ölü ve canlı hücreler thoma lamı yardımıyla sayılmıştır. Sağkalım grafiği incelendiğinde hem 4T1 hem de B16F10 hücrelerinde MG-132 muamelesi sonrasında kontrole göre anlamlı bir fark elde edilmiştir (p < 0.05). Bu sitotoksik etkinin protein sentezindeki inhibisyondan kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek için eIF2? fosforilasyonunu inceledik. 4T1 meme kanser hücrelerini 6 saat süreyle %0.1 DMSO veya 50 µM MG-132 ile muamele ettikten sonra hücreler lizis edildi. Daha sonra elde ettiğimiz total proteinlerden SDS-PAGE ve Western-blot metotlarını kullanarak sırasıyla eIF2? (P) ve total eIF2? protein seviyelerine baktık. Kontrol gruplarında herhangi bir değişiklik olmazken 50 µM MG-132 ile muamele edilmiş hücrelerde eIF2? (P) seviyesinde artış gözlenmiştir. Total eIF2? protein miktarında ise bir değişiklik olmamıştır. MG132 ile kısa bir süre muamele edilen 4T1 hücrelerinde, proteozom inhibisyonu sonucu Hsp70 protein miktarında da eIF2? fosforilasyonuna benzer bir şekilde önemli bir artış gözlenmiştir. Bu sonuç, proteozom inhibisyonundan sonra görülen eIF2? (P)'nundaki yükselmeden Hsp70 proteinin bir rolü olabileceğini göstermektedir.

In this work, the effects of MG-132, one of the 26S proteasome inhibitors which are used as alternatives of the anti-cancer drugs nowadays, on morphologic changes of cancer cell lines and the role of Hsp70 on eIF2? phosphorylation causing inhibition of protein synthesis following proteasome inhibition are investigated. In our work, in 4T1 breast and B16F10 melanoma cancer cells treated in a time-dependent manner with 50 ?M MG-132, morphologic changes commonly observed in apoptotic cells were observed starting from 8 hour; however, such changes were not observed in control group treated with 0.1% DMSO. Cell rounding, shrinkage, apoptotic vesicules in the membrane are characteristic features of this type of cell death. In addition, in order to determine the cell death, after treating with 0.1% DMSO or 10 ?M MG-132, dead and live cells were counted using typan blue exclusion test with the help of a hemacytometer. When the survival graph is examined, significant differences in MG-132 treated 4T1 and B16F10 cells as compared to the control were obtained (p < 0.05). In order to determine whether this cytotoxic effect is due to the inhibition of the protein synthesis, we examined eIF2? phosphorylation. 4T1 breast cancer cells were lysed after treating with 0.1% DMSO or 50 µM MG132 for 6 hour. Afterwards, we examined the level of eIF2? (P) and total eIF2?, respectively from the total protein using SDS-PAGE and Western-blot techniques. No change was observed in control groups; however, the level of eIF2? (P) was increased in cells treated with 50 µM MG132. No change was observed in the level of total eIF2?. In 4T1 cells treated for a brief time with MG132, a significant increase in Hsp70 level in parallel to eIF2? phosphorylation was observed in response to proteasome inhibition. This result suggests that Hsp70 may play a role in the observed increase in eIF2? after 26S proteasomal inhibition.