Proteozom inhibisyonun 4T1 meme ve B16F10 melanoma hücrelerindeki apoptotik etkilerinin araştırılması

Abstract

Son zamanlarda anti-kanser çalışmalarında proteozom inhibisyonuna olan ilgi artmıştır. Proteozom inhibisyonunun bazı hücresel fonksiyonları etkilediği ve apoptozisi başlatabileceği ortaya çıkmıştır. Bu tez çalışmasında; proteozom inhibisyonunun 4T1 meme kanseri ve B16F10 melanoma hücreleri üzerinde meydana getirdiği apoptotik etkiler araştırılmıştır. Çalışmamızda, 48 saat süreyle farklı bortezomib konsantrasyonları (10 nM, 100 nM, 500 nM, 1 µM) ile muamele edilen B16F10 hücreleri; apoptoziste sıklıkla görülen hücrelerin petri kabının dibinden kalkması, küreselleşme, küçülüp büzülme, komşu hücrelerden ayrılma ve üzerine düşen ışığı daha çok yansıtma gibi morfolojik değişimlere uğramışlardır. Ayrıca, apoptozisin önemli belirteçlerinden olan DNA fragmentasyonu da gözlenmiştir. 4T1 hücrelerinde B16F10 hücrelerine göre daha yüksek konsantrasyonlarda (100 nM, 500 nM, 1 µM) apoptotik değişimler gözlenmiştir. Yine çalışmamızda; 48 saat süre ile 0.5 µM MG132 ile muamele edilen B16F10 hücrelerinde apoptotik değişimler benzer şekilde meydana gelirken, 0.5 µM MG132 ile 48 saat muamele edilen 4T1 hücrelerinde çok fazla değişim gözlenmemiştir. Ayrıca, 10 µM bortezomib ve 6 saat süreyle muamele edilen B16F10 ve 4T1 hücrelerinde Western blot yöntemiyle p53 proteini miktarı incelendiğinde; yalnız B16F10 hücrelerinde p53 artışı gözlenirken, 4T1 hücrelerinde artış görülmemiştir. Bu sonuçlar; B16F10 hücrelerinin 4T1 hücrelerine göre, proteozom inhibitörlerine karşı daha hassas olduklarını ve bu hassasiyette p53 proteininin önemli rol aldığını göstermektedir. Daha sonra yapılan deneylerde, hem 4T1 hem de B16F10 hücrelerinde kaspaz-3 enzim aktivitesinde önemli artış gözlenmiştir; fakat, bu sonuç Western blot analizleriyle doğrulanamamıştır. Western blot deneyleri proteozom inhibisyonu sonucu kaspaz 3'ün aktive olmadığını göstermiştir. Bu sonuçlar, aktivite deneylerinde görülen kaspaz-3 aktivitesindeki artışın muhtemelen diğer kaspazlardan (örneğin, kaspaz-7) kaynaklanma ihtimali olduğunu göstermektedir. Ayrıca, Western blot analizleri bortezomib ile muamele edilen 4T1 ve B16F10 hücrelerinde ubiquitin-protein konjugatları miktarının arttığını göstermiştir. Elde edilen sonuçlar; proteozom inhibisyonunun apoptozisin uyarılmasında etkili olduğunu ve kanser tedavisinde alternatif olarak kullanılabileceğini göstermektedir.

It has been releaved that proteasome inhibition affects several cellular functions and induces apoptosis. In this thesis study, the apoptotic effects of proteasome inhibition on 4T1 breast cancer and B16F10 melanoma cells has been investigated. In our study, B16F10 cells treated with different bortezomib concentrations (10 nM, 100 nM, 500 nM, 1 µM) for 48 hours have showed morphological changes such as detaching from petri dish, rounding, shrinkage, seperating from adjacent cells and reflecting more light, which are commonly observed in apoptotic cells. In addition, DNA fragmentation, an important indicator of apoptosis, was observed. In 4T1 cells, apoptotic changes were observed with higher concentrations (100 nM, 500 nM, 1 µM) as compared to B16F10 cells. Furthermore, while apoptotic changes were similary observed in B16F10 cells treated with 0.5 µM MG132 for 48 h, no significant changes were observed in 4T1 cells treated with 0.5 µM MG132 for 48 h. Also, when p53 protein level was investigated with Western blot in 10 µM bortezomib treated B16F10 and 4T1 cells for 6 h, an increase in p53 was observed only in B16F10 cells, but not in 4T1 cells. These results show that B16F10 cells are more sensitive to the proteasome inhibition as compared to 4T1 cells, and in this sensitivity p53 protein plays a significant role. In fallow-up experiments, a significant increase in caspase-3 enzyme activity observed in both 4T1 and B16F10 cells; however, this result was not confirmed by Western blot analyzes. Western blot experiments did not show an increase caspase-3 activity in response to proteasome inhibiton. These results show that the increase in caspase-3 activity observed in the activity experiments may thus result from other caspases (e.g., caspase-7). In addition, Western blot analyzes showed that ubiquitin-protein conjugates are increased in bortezomib-treated 4T1 and B16F10 cells. The results obtained indicated that proteasome inhibition is effective in triggering apoptosis and may be used as an alternative in the cancer therapy.