Cyprinus carpio L. 1758 (osteichthyes:cyprinidae)`nun pankreas, ince bağırsak ve karaciğer lipaz enzimlerinin saflaştırılması ve bazı biyokimyasal özelliklerinin karşılaştırılması

Abstract

ÖZET DOKTORA TEZİ CYPRINUS CARPIO L. 1758 (OSTEICHTHYES:CYPRTNIDAE)'NUN PANKREAS, İNCEBAĞIRSAK VE KARACİĞER LİPAZ ENZİMLERİNİN SAFLAŞTIRILMASI VE BAZI BİYOKİMYASAL ÖZELLİKLERİNİN KARŞILAŞTIRILMASI Naci DEĞERLİ Cumhuriyet Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman Doç. Dr. M. Ali AKPINAR Bu çalışmada triaçilgliserolleri hidrolizleyen lipaz enzimi Cyprinus carpio L. 1758'nun farklı dokularından saflaştırılmış ve bazı kinetik parametreleri tayin edilmiştir. Lipaz dietilaminoetil (DEAE) selüloz ile iyon değişim, fenil sefaroz ile hidrofobik etkileşim (HIC), Q-sefaroz ile fast flow anyon değişim (FFC) ve hidroksiapatit birlikteliği ile % 20 PEG ile çöktürülmüş sitozolik fraksiyondan saflaştırılmıştır. Bu saflaştırma basamakları sonucunda aktivite boyama tekniğine bağlı esteraz aktivitesiyle birlikte poliakrilamid jel elektroforezlerinde yalnızca bir aktif band görülmüştür. Molekül ağırlıkları sırasıyla pankreatik, incebağırsak ve karaciğer lipazları için denatüre edici etken içermeyen poliakrilamid gel elektroforez (PAGE) koşullarında 59, 60.7 ve 62.7 kDa olarak tayin edilmiştir. Lipaz enzimi trigl i seritler arasında tributrin, nitrofenol esterler arasında ise pNPB'a karşı yüksek lipolitik ve esteraz aktiviteleri göstermiştir. Kinetik analizler sırasıyla pankreas, incebağırsak ve karaciğer lipazları için Vmax= 2.03, 0.33 ve 0.23 jimol.dk`1 ve Km= 5.3X10`4, 2.0X10`4 ve 0. 62x1ü`4 M p-nitrofenil bütürat (pNPB) olduğunu göstermiştir. Üç enzimin optimal sıcaklığı ve kararlılığı 28 °C olarak saptanmıştır. Pankreas ve incebağırsak lipazları için optimal aktivite pH 7.60 da, karaciğer için ise pH 8.10 da saptanmıştır. Tek değerlikli iyonlar yüksek dozda dahi aktivatör iken, iki değerlikli olanların düşük dozlarda aktivatör olduğu saptanmıştır. Diğer yandan ağır metaller aktiviteyi azaltmışlardır. Lipazlar 3-merkaptoetanol (BME) ve dithiothreeritriol (DTT) tarafından inaktive edilmezlerken, sodyum florür (NaF) ve fenil metil sülfonil florür (PMSF) tarafından yüksek dozlarda inhibe olmaktadırlar. Safra tuzu ve iyonik olmayan deterjanlar gibi yüzey aktif bileşenleri düşük dozda düşük inhibisyon etkisi gösterirken, miktara bağlıolarak yüksek dozlarda p-nitrofenil bütürat (pNPB) substratı ile inhibisyon oluşturmuştur. Anahtar Kelimeler: Cyprinus carpio, saflaştırma, triaçilgliserol lipaz, balık dokusu

Ill SUMMARY PhD. PURIFICATION OF LIPASE FROM PANCREAS, INTESTINE AND LIVER IN CYPRINUS CARPIO L. 1758 AND COMPARITION OF THEIR SOME BIOCHEMICAL PROPERTIES Naci DE?ERLİ Cumhuriyet University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biologoy Supervisor Ass. Prof. Dr. M. Ali AKPINAR In the present study, lipase, an enzyme that hydrolyzes triacylglycerol from different tissues of Cyprinus carpio L., have been purified and some kinetics parameters determined. The lipase were purified by the combination of diethylaminoethyl (DEAE) cellulose anion-exchange, hydrophobic intereaction (HIC) with fenil sepharose, fast flow anion exchange (FFC) with Q-sefaroz, and hydroxyapatite choromatography from cytosolic fraction, precipitated with 20 % polyethylene glycol (PEG). By these purification steps, a single band for active lipase were seen in polyacrylamide gel (PAGE) electrophoresis, associted with esterase activity according to activity staining. Their moleculer weights have been estimated by PAGE under non-denaturing conditions 59, 60.7, and 62.7 kDa for pancreatic, intestinal, and liver lipase, respectively. The lipase showed higher lipoliytic and esterase activity toward tributrin and pNPB among the triglicerit and nitrophenil ester examined. Kinetics analysis indicated that Vmax- 2.03, 0.324, and 0.223 umol.dk.`1 and Km= 5.3x10`*, 2.0x1ü`4, and 0.62x1ü`4 M p-nitrophenyl byturate (pNPB) for pancreatic, intestinal, and liver lipase, respectively. The activity and stability of the three enzymes were found maximum at 28 °C. Optimal activity for lipase occured at pH 7.60 for pancreas and intestinal, 8.10 for liver. Monovalent ions had stimulatory efffect on enzymes activity, even at higher dose, while divalent ions at lower dose. On the other hand activity were reduced heavy metal compound. The lipase were not inactivated B-mercapto ethanol (BME) and dithioerythritol (DTT) but inhibited by natrium fluoride (NaF), phenylmethanesulphonyl fluoride (PMSF) at higher dose of these substances. Surface active compound such as bile salts and non-ionic detergents had little inhibitory effect atIV lower dose, but inhibited lipase activity at higher, in concentration-dependent manner with pNPB substrate. Key Words: Cyprinus carpio, purification, triacylglycerol lipase, fish tissue.