Doğal Apomikt arabis türlerinden FIS geninin (fertilization independent seed) karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, triploid apomikt Boechera (Brassicaceae) türleri B. holboellii ve B. gunnisoniana'dan Arabidopsis thaliana FIS2 geni ortoloğu karakterize edilmiştir.Çalışmada, total RNA izolasyonu FIS2 genin ifade olduğu tahmin edilen çiçek ve bakla dokularından yapılmıştır. Boechera türlerine ait FIS2 gen ortoloğu A. thaliana'ya özgün primerler kullanılarak RT-PCR aracılığı ile çoğaltılmıştır. Bu primerlerden yaklaşık 2250 bç büyüklüğünde DNA bandı beklenmiştir. RT-PCR ürünleri %0,5'lik agaroz jel elektroforezi ile ayrılmış ve ethidium bromide ile boyandıktan sonra ilgili DNA bandı U.V altında görüntülenmiştir. Bu bant jelden izole edilmiş ve pJET1/blunt plazmit vektöre aktarılmıştır. Daha sonra pJET/blunt plazmit JM-109 ve JM-107 kompetent Escherichia coli hücre hatlarına transforme edilmiştir. Rekombinant koloniler, koloni PCR aracılığı ile tespit edilmiş ve bu kolonilerden plazmitler izole edilmiştir. Ardından rekombinant plazmitler restriksiyon endonükleazlar ile kesilerek beklenen büyüklükteki DNA bandını taşıdıkları doğrulanmıştır. Son olarak, çalışmada izole edilen PCR ürünlerinin dizi analizleri yapılmış ve AtFIS2 geni ile %83-87 oranında benzerlik gösterdiği bulunmuştur.Bu sonuçlar, triploid apomikt Boechera türlerinde FIS2 geni ortoloğunun mevcut olduğunu ve çiçek ve bakla oluşumu sırasında bu genin ifade edildiğini göstermiştir.Anahtar Kelimeler: FIS2, FIE, MEA, polycomb group proteinler, Arabidopsis thaliana, Boechera

In this study, the orthologs of Arabidopsis thaliana FIS2 (AtFIS2) gene, BhFIS2 and BgFIS2, were characterized from triploid apomict B.holboellii and B. gunnisoniana (Brassicaceae).Total RNA from flower and silique tissue (where most abundant FIS2 gene products available) were isolated and reverse transcribed into cDNA. Then, the FIS2 gene ortologs were amplified by RT-PCR using AtFIS2 primers and expected to obtain 2250 bp DNA bands. RT-PCR products separated in 0,5% agarose gel electrophoresis were stained with Ethidium Bromide and recorded on U.V. table. DNA bands were purified from gel and ligated into pJET1/blunt plasmid vector. Then, pJET/blunt plasmids were transformed to JM-109 and JM-107 compotent Escherichia coli cell line. Recombinant colonies were analysed by colony PCR. Plasmids were isolated from verified colonies. Recombinant plasmids were verified by restriction endonuclease digestion. Finally, PCR products were sequenced which revealed that 83-87% similarity to AtFIS2 gene.These results showed that AtFIS2 gene orthologs, BhFIS2 and BgFIS2, are present in triploid apomict Boechera sp.(Brassicaceae) and express during flower and silique development.Keywords: FIS2, FIE, MEA, polycomb group proteins, Arabidopsis thaliana, Boechera