Fare embriyonik kök hücresinden farklılaştırılan epidermal seri hücrelerinden keratinositlerin primer yara iyileşiminde kullanımı

Abstract

Deri vücudun iç ortamının bütünlüğü ve çevreye karşı korunmasında hayati bir rol oynar. Yanık ve deri yaralanmalarının en az hasarla tedavi edilmesi için doku mühendisliğince otolog veya allojenik olarak embriyonik veya erişkin kök hücrelerinden oluşturulan deri greftlerinin oluşturulması ve kullanımı gündemdedir. Pluripotent olan embriyonik kök hücreler uygun kültür ortamı sağlandığında farklılaşmadan çoğaldıkları gibi, ortamın değiştirilmesi ile farklılaşmaları sağlanabilir. Bu çalışmada amacımız fare embriyonik kök hücrelerinden farklılaştırılan keratinositlerin, farede oluşturulan cerrahi yara modeline transfer edildikten sonra yara iyileşmesine ve yara iyileşmesi sırasında salgılanan moleküllere etkilerinin araştırılmasıdır.Embriyonik kök hücrelerden embriyoblastlar oluşturularak matrijel ve BMP-4 içeren kültür ortamında keratinosit benzeri hücreler elde edildi. Farklılaştırılan keratinositler % 4' lük paraformaldehit ile tespit edildikten sonra sitokeratin-8 ve sitokeratin-14 dağılımları immunohistokimyasal teknik ile, hücrelerin ultrastrüktürel özellikleri, gluteraldehit ve osmik asit ile tespit edildikten sonra agara gömülerek tanımlandı. Farklılaştırılan hücreler yara yerine transfer edilmeden önce Brd-U ile işaretlendi. Deneysel cerrahi yara modeli oluşturmak üzere 60 adet Bulb C tipi fareler dört eşit gruba ayrıldı [deney (n=15), sham (n=15), kontrol (n=15), ve sağlam deri (n=15)]. Sağlam deri grubuna hiçbir işlem uygulanmadı buna karşılık kontrol grubunda sadece yara oluşturuldu. Sham grubunda yara oluşturulduktan sonra sadece mesh transfer edilirken, deney grubunda kültür ortamında elde edilen keratinositler mesh üzerinde yaraya transfer edildi. Tüm gruplardan cerrahi müdahalenin 3., 5. ve 7. günlerinde doku örnekleri ışık ve elektron mikroskobik inceleme için alındı. Işık mikroskobik inceleme için alınan doku örnekleri % 10 formalin ile tespit edildi ve rutin parafin takip işleminden sonra alınan seri kesitlerin bir kısmı H-E ve Masson Trikrom ile diğer kesitler ise sitokeratin-8, sitokeratin-14, EGF, IL-8, FGF-1, FGF-2, MCP-1 ve kollajen-1 dağılımlarını belirlemek için indirekt immunoperoksidaz yöntemi ile boyandı. Brd-U ile işaretlenmiş hücrelerin analizi için anti-Brd-U boyaması yapıldı. Elektron mikroskobik inceleme için alınan doku örnekleri gluteraldehit ve osmik asit ile tespit edilip epona gömülerek yarı ince ve ince kesitler alındı.Kültür ortamında farklılaştırılan hücrelerin, erken ve geç dönem keratinosit farklılaşma belirteçleri olan sitokeratin-8 ve 14 immunoreaktivitelerinin pozitif olması ve ultrastrüktürel olarak benzer özellikleri taşıması, keratinosit benzeri hücreler olduklarını düşündürdü. Işık mikroskobik incelemede 3. günde deney grubunda yara bölgesinde keratinosit hücrelerinden oluşan epitelizasyon gözlenirken kontrol ve sham gruplarında yara yeri kenarlarında keratinosit hücrelerinin henüz proliferasyonunun başladığı ve epitelizasyonun olmadığı gözlendi. Üçüncü günden itibaren deney grubunda yara bölgesine Brd-U ile işaretlenerek transfer edilen hücrelerin çekirdeklerinin, anti-Brd-U boyaması ile pozitif olarak boyandığı gözlendi. İndirekt immunohistokimyasal incelemede, sitokeratin-8 immunoreaktivitesinin, kontrol grubunda 3. ve 5. günde negatif, 7. günde pozitif; deney grubunda ise 3. ve 5. günde pozitif, 7. günde negatif olduğu tespit edildi. Sham grubunda, sitokeratin-8 immunoreaktivitesinin her üç günde de pozitif, sağlam deride ise her üç günde de negatif olduğu izlendi. Sitokeratin-14 immunoreaktivitesi sağlam deride 3., 5. ve 7. günde kuvvetli pozitif boyanırken, deney, kontrol ve sham gruplarında ise, 3. günde zayıf şiddette veya negatif olarak saptandı. Kontrol ve sham gruplarında 5. ve 7. günlerde sitokeratin-14 immunoreaktivitesi orta şiddette, deney grubunda ise şiddetli pozitif olarak gözlendi. EGF immunoreaktivitesi, sağlam deri grubunda her üç günde de negatif iken, deney, kontrol ve sham gruplarında 3. günde negatif, 5. ve 7. günlerde özellikle 7. günde deney grubunda daha fazla olmak üzere her üç grupta da pozitif boyandığı saptandı. IL-8 immunoreaktivitesi, sağlam deri grubunda her üç günde de negatif, deney ve kontrol grubunda 3. günde en fazla olmak üzere tüm günlerde pozitif olduğu, sham grubunda 3. ve 7. günde zayıf, 5. günde ise orta şiddette olduğu izlendi. FGF-1 immunoreaktivitesinin tüm gruplarda ve 3., 5. ve 7. günlerde negatif olduğu gözlendi. FGF-2 immunoreaktivitesi, tüm gruplarda ve 3., 5. ve 7. günlerde pozitif olarak gözlenir iken, 5. günde FGF-2 immunoreaktivitesine sahip hücrelerin deney grubunda daha fazla olduğu saptandı. MCP-1 immunoreaktivitesinin sağlam deri grubunda her üç günde de bağ dokusu içerisinde zayıf şiddette olduğu gözlenir iken deney, kontrol ve sham gruplarında 3. ve 5. günde orta şiddette pozitif, 7. günde deney grubunda yine orta şiddette, kontrol ve sham grubunda ise giderek azalan şiddette olduğu saptandı. Kollajen-1 immunoreaktivitesinin sağlam deri grubunda dermiste pozitif olduğu ve günler arasında fark olmadığı gözlenir iken 3. günde deney grubunda negatif, kontrol ve sham grubunda zayıf şiddette ve 5. ve 7. günlerde giderek azaldığı, deney grubunda ise giderek arttığı izlendi. Örneklerin elektron mikroskobik incelenmesinde 3. günden itibaren deney grubunda epitelizasyonun başladığı ve keratinositlerin yara bölgesinde yer aldığı gözlendi.Fare embriyonik kök hücrelerinden farklılaştırılan keratinositlerin, farede oluşturulan cerrahi yara bölgesine transferini takiben anti-Brd-U ile boyanmış olması varlıklarını devam ettirdiklerinin bir göstergesi olarak değerlendirildi. Farklılaştırılan hücrelerin, yara bölgesinde yara iyileşmesinde rol oynayan moleküllerden kollajen-1, EGF ve sitokeratin-14 salınımının geç dönemde; sitokeratin-8, IL-8, FGF-2 ve MCP-1 salınımının ise erken dönemde artışına neden olduğu tespit edildi. Farklılaştırılan hücrelerin yara iyileşmesi evrelerini hızlandırdığı ve yara iyileşmesi üzerine olumlu etki yaptığı sonucuna varıldı.

The skin plays a crucial role in protecting the body against the environment and integrity of the body?s internal milieu. The treatments of burns and skin injuries with less damage using autologous or allogenic skin grafts constitute from adult or embryonic stem cells in tissue engineering are at the forefront. Pluripotent embryonic stem cells are able to proliferate in suitable condition without differentiation, in addition to this, the cells can differentiate when the culture condition is changed. The aim of this project is to investigate the effects of keratinocytes which differentiated from mouse embryonic stem cells after transferring on the surgical wound model of the mouse during wound healing and secreted molecules which after wound healing.Keratinocyte like cells were obtained from embryoblasts which derived from embryonic stem cells on matrigel and culture media supplemented with BMP-4. Differentiated keratinocytes were fixed in 4% paraformaldehyde and distribution of cytokeratin-8 and cytokeratin-14 using with immunohistochemical technique, and the ultrastructural properties of the cells were analyzed after fixation with glutaraldehyde and osmic asid and embedded in an agar. The keratinocytes are labelled with Brd-U before transferring to the wound area. For creating experimental surgical wound model 60 Bulb C type mouse divided in 4 equal groups [experimental (n=15), control (n=15), sham (n=15) and healthy skin (n=15)]. In healthy skin group nothing is done however in control group only wound is made. In sham group, only mesh is transferred after the wound is made, while in experimental group, the mesh with keratinocytes which obtained from culture condition were transferred on to the wound area. From all groups, the samples were collected after the surgical process on the 3th, 5th and 7th day for both light and electron microscopic analyses. For the light microscope analyze, samples were fixed in 10% formalin and sections were taken after routine paraffin process, and some of the sections were stained either H-E or Masson Trichrom, also the rest of the sections were stained with indirect immunoperoxidase technique in order to determine distributions of cytokeratin-8, cytokeratin-14, EGF, IL-8, FGF-1, FGF-2, MCP-1 and collagen-1. For analyzing Brd-U labelled cells, the sections were also stained with anti-Brd-U. For electron microscope analyze, samples were fixed in glutaraldehyde and osmic asid, were then embedded in epon and half thin and thin sections were taken.The differentiated cells in culture condition were both positive for early and late term keratinocyte differentiation markers, cytokeratin-8 and cytokeratin-14 and similarity ultrastructurally with keratinocytes, were thought keratinocyte-like cells. In light microscopic analyze, on the 3th day in experimental group, on the wound area there was an epithelialization that consist of keratinocyte cells, while in control and sham groups near the wound area, only keratinocytes which were just started to proliferate were observed but there was no evidence about epithelialization. From the 3th day in experimental group in the wound area, Brd-U labelled transferred cells?s nucleuses were stained positively with anti-Brd-U stain.In indirect immunohistochemistry analyze, while cytokeratin-8 immunoreactivities were negative in control group on the 3th and 5th days, it was positive on the 7th day, in experimental group on the 3th and 5th days were positive, but on the 7th day it was negative. In the sham group, cytokeratin-8 immunoreactivities in all days were positive, while in healthy skin it was negative in all days. The cytokeratin-14 immunoreactivity in healthy skin on the 3th and 5th and 7th days stained strongly positive while in experimental, control and sham groups it was minimal or negative on the 3th day. In control and sham groups cytokeratin-14 immunoreactivity on the 5th and 7th days was moderate but in experimental group it was strongly positive. EGF immunoreactivity in healthy skin group was negative in all days while it was negative on the 3th day and positive on the 5th and 7th days in experimental, control and sham groups, but, immunoreactivity was especially detectable on the 7th day of experimental group. IL-8 immunoreactivity was negative in healthy skin group in all days, in experimental and control group in all days immunoreactivities were positive but it was more on the 3th day than the other days, in sham group on the 3th and 7th days it was minimal, on the 5th day it was moderate. FGF-1 immunoreactivity in all groups on the 3th, 5th and 7th days was negative. FGF-2 immunoreactivities in all groups on the 3th, 5th and 7th days were positive while FGF-2 immunoreactivity positive cells were more on the 7th day of experimental group than others. MCP-1 immunoreactivity in healthy skin group in all days was minimal in connective tissue while in experimental, control and sham groups on the 3th and 5th days was moderate where as on the 7th day in experimental group it was moderate and in control and sham group it was lessen. Collagen-1 immunoreactivity in healthy skin group was positive in dermis and there was no difference between the days , however, it was negative on the 3th day in experimental group, in control and sham group it was minimal and the immunoreactivity was gradually decreased on the 5th and 7th days, while in experimental group it was gradually increased. Electron microscope analyze of samples, in experimental group beginning from the 3th day it was observed that epithelialization started and keratinocytes were on the wound area.Keratinocytes which derived from mouse embryonic stem cells after transferring on the surgical wound area were evaluated healty because of positively stained with anti-Brd-U. Differentiated cells were demonstrated increased secretion of molecules that collagen-1, EGF and cytokeratin-14 secretion in late term and the cytokeratin-8, IL-8, FGF-2 and MCP-1 secretion in early term during wound healing on wound area. In conclusion differentiated cells are accelerate and influence positively to the wound healing stages.