Targeted metabolomic analysis of central carbon metabolism on model plant Brachypodium distachyon to elucidate physiological response to drought stress

Abstract

Akdeniz ve Ortadoğu bölgesi yerel bitkisi olan Brachypodium distachyon, buğday, arpa, yulaf ve çavdar gibi beslenmede temel öneme sahip tahılların da içinde bulunduğu çim ailesinin (Poaceae) bir üyesidir. B. distachyon, kompakt bir genoma sahip olma (272 Mb), 5 çift kromozom (2n=10), kısa yaşam döngüsü (~12 hafta), kolay gen aktarımı, kendi kendine döllenmesi ve basit büyüme koşulları gibi özellikleri ile model organizma olmak için gereken bütün vasıflara sahiptir. Model bitki özellikleri ve önemli tahıllar ile yakın akrabalığı, Brachypodium'u tüm serin iklim tahıl türlerinin, özellikle de hububatların geliştirilmesi için dikkat çekici bir model bitki haline getirmektedir. Son yıllarda, Brachypodium üzerine birçok genomik ve transkriptomik çalışmalar yapılmasına rağmen, bu çalışmalar, mRNA ve protein seviyelerinin korelasyon göstermemesi proteinlerin translasyon sonrası enzimatik olarak aktif olmaması gibi temel sebeplerle, biyokimyasal reaksiyonların oluşturduğu metabolik ağın anlaşılması konusunda yetersiz kalmaktadır. Fizyolojiye en yakın omik seviye olarak önemine rağmen, metabolomik alanındaki çalışmalar, Brachypodium için nispeten başlangıç seviyesindedir. Bu çalışmanın amacı, kuraklık stresinin metabolizma üzerindeki etkisini aydınlatmak için Brachypodium distachyon'a uygun kantitatif metabolomik platformu oluşturmak, özellikle, ekstraksiyon protokollerini optimize etmektir. Ekstraksiyon protokollerinin validasyonu için, raportör metabolitler (ATP, glikoz ve nişasta) kullanılmıştır ve yüksek kapsamlı metabolom verileri elde etmekten çok bu metabolitlerin kantitasyonu üzerine odaklanılmıştır.Raportör metabolitler üzerinden, Brachypodium distachyon'da iki farklı genotip kullanılarak (her bir genotip 2 populasyon ile temsil edilir), kuraklık stresinin ve genotipik varyasyonun etkisi değerlendirilmiştir. Raportör metabolitlerin analizi ekstraksiyon protokollerine bağlı olarak verimin değiştiğini göstermiştir. Genotip farkı, protokollerin ekstraksiyon verimini önemli ölçüde etkileyerek, protokol optimizasyonunun ve genotipe spesifik ekstraksiyon yöntemlerinin gerekliliğini ortaya çıkarmıştır. Raportör metabolitlerin kantitatif analizi kuraklık stresine bağlı belirgin değişimlere işaret etmektedir, ancak bu değişiklikler metabolizmalar arasında farklılık göstermektedir: enerji metabolizması glikoz ve karbonhidrat metabolizmasından farklı cevap vermektedir. ATP seviyeleri 2,92 10-5 - 1,77 10-3 nmol/g FW (yaş ağırlık) arasında değişmekte olup ekstraksiyon protokolleri arasında farklı bir eğilim bulunmuştur. Kuraklığa cevap olarak, glikoz seviyeleri 1-4 kat arasında artış göstermiştir. Brachypodium yapraklarındaki nişasta seviyeleri, 0.02-2,7% FW, kuraklık stresine cevap olarak belirgin ya da tutarlı bir değişiklik göstermemiştir. Elde edilen bulgular, kuraklığın Brachypodium metabolizması üzerinde belirgin bir etkisi olduğunu göstermiştir. Bu çalışma, ileriki aşamada tarımsal açıdan önemli ekin türlerinin geliştirilmesi için kuraklık stresine cevap üzerine metabolomik çalışmalara yardımcı niteliktedir.

Brachypodium distachyon which is native to the Mediterranean and Middle East Region, is a member of grass family (Poaceae) that also includes a number of cereals, providing the bulk of energy needed for human diet like wheat, barley, rye and oat. B. distachyon, has all desirable features to be a model organism, such as having a compact genome (272 Mb), 5 pair of chromosomes (2n=10), short generation time (~12 weeks), easy genetic transformation, self-fertility and simple growth requirements. The model plant properties and its close relationship to important crops, makes Brachypodium an attractive model plant for improvement of all temperate crop species, particularly the cereals. In recent years, in spite of an increasing interest in genomic and transcriptomic studies on Brachypodium, these are shown to be insufficient in understanding metabolic networks composed of biochemical reactions, mainly due to lack of correlation between mRNA and protein levels and the lack of enzymatic activity of proteins upon translation. Despite its importance of being the closest omic level to physiology, studies on metabolomics for Brachypodium are at their infancy. In order to elucidate the effect of drought stress on metabolism, the objective of this study is to set up quantitative metabolomics platform for Brachypodium distachyon, in particular, to optimize metabolite extraction protocols. For validation of extraction protocols, we used reporter metabolites (specifically ATP, glucose and overall starch) and focused on quantification of these, rather than overall,high-coverage metabolome data. As such, we evaluated the effect of drought stress and genotypic differences based on these reporter metabolites in model plant Brachypodium using two different genotypes (each represented by 2 populations). Careful analysis of reporter metabolites revealed that there is no `one-protocol-fits-all`, meaning that there is a significant difference in metabolite recoveries upon different extraction protocols. Moreover, the extraction efficiency is also affected by different genotypes, which resultingly calls for optimization of protocols, tailor-made for a genotype. Quantitative analysis of reporter metabolites points to significant changes upon drought stress, yet the resulting change differs from one metabolism to another, i.e. energy metabolism responds differently than glucose and carbohydrate metabolism. ATP levels exhibited (ranging from 2.92 10-5 – 1.77 10-3 nmol/g FW (fresh weight)) a different trend between the extraction protocols. Glucose levels showed 1-4 fold increase upon drought stress. Starch levels in Brachypodium leaves, ranging between 0.02-2.7% FW, exhibited no significant or consistent change, as a response to drought stress. On the basis of these results, it can be concluded that the impact of drought stress on Brachypodium metabolism was significant and this study could aid for further metabolomics studies on drought stress response for the improvement of agriculturally important crops.