Doğal periost tabakasını taklit eden kemik hücre dışı matriksi kaynaklı biyolojik filmlerin üretimi ve karakterizasyonu

Abstract

Yapılan tez çalışmasında, hücre dışı matriks (HDM) temelli biyofilmler sığır tibiasının trabeküler kısmı deselülerize edilerek üretilmiştir. İnsan adipoz mezenkimal kök hücrelerin (iAMKH) bu biyofilmler üzerindeki davranışı kemik dokusu mühendisliği açısından araştırılmıştır. Bu amaçla, ticari amaçla kesimi yapılan sığırların tibiası alınarak trabeküler kısmı parçalara ayrılmıştır. Parçalara ayrılan trabeküler kemik dokuları sırasıyla Trizma.HCl/ Etilendiamin tetraasetik asit (EDTA), Triton X-100, DNAz, RNAz ve perasetik asit ile muamele edilerek deselülerize edilmiştir. Deselülerize trabeküler kemik dokuları (dTKD) pepsin enzimi ile sindirilmiştir ve 10X Sodyum klorür içeren fosfat tamponu (PBS), 0,1 N NaOH kullanılarak nötralize edilmiştir. Çalışmamızda biyofilm elde etmek amacıyla 2 farklı yöntem kullanılmıştır. 1. yöntem ile oluşturulan biyofilmler N-hidroksi süksinimit- N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etil karbodiimit (NHS-EDC) kullanılarak çapraz bağlama yapılmıştır. 2. yöntem ile oluşturulan biyofilmlerde ise çapraz bağlama yapılmamıştır. 2 farklı yöntem ile oluşturulan biyofilmler üzerindeki iAMKH'lerin; tutunma, proliferasyon ve farklılaşma gibi hücresel davranışları belirlenmiştir. Bu amaçla histokimyasal değerlendirme (H & E, Alizarin Red S ve von Kossa), immünhistokimyasal değerlendirme (osteonektin, osteokalsin) ve hücresel canlılık testleri (XTT, MTT) yapılmıştır. 1. yöntem ile oluşturulan biyofilmler üzerinde iAMKH'ler film yüzeyi ile entegre olamamıştır ve çapraz bağlamanın etkisinden dolayı film içerisine girememiştir. 2. yöntem ile oluşturulan biyofilmlerde iAMKH'ler film ile bütünleşerek çoğalmıştır. Deselülerizasyon işleminin başarısını değerlendirmek için DNA içerik analizi yapılmıştır. Yapılan DNA içerik analizi sonucunda çift sarmal DNA miktarı 46,00 ± 1,36 (n=3) ng/mg olarak belirlenmiştir ve bu sonuçla başarılı bir deselülerizasyon işleminin yapıldığı gösterilmiştir. Film ve dTKD sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), glikozaminoglikan (GAG) ve hidroksiprolin içerik analizi yapılarak karakterize edilmiştir. Film ve dTKD numuneleri için sırasıyla GAG miktarı 4,76 ± 0,97 μg GAG/mg kuru ağırlık (n=3), 5,21 ± 0,24 μg GAG/mg kuru ağırlık (n=3) olarak ölçülmüştür. Film ve dTKD numunelerinin hidrosiprolin miktarı 45,12 ± 13,21 μg /mg kuru ağırlık (n=3), 11,54 ± 3,96 μg/mg kuru ağırlık (n=3) olarak hesaplanmıştır. dTKD'nın fizikokimyasal karakterizasyonu termogravimetrik analiz (TGA), dinamik mekanik analiz (DMA) ve fourier dönüşümlü kızıl ötesi (ATR-FTIR) analizleri yapılarak belirlenmiştir. Yapılan analiz sonuçları literatür ile karşılaştırıldığında ise benzer sonuçların elde edildiği görülmüştür. Bu sonuçlara göre üretilen biyofilmlerin, kemik doku mühendisliği alanında kullanılabilmesi adına potansiyele sahip olduğu düşünülmüştür.

In this study, extracellular-matrix based films were fabricated from the bovine trabecular tissue. The behaviour of human adipose mesenchymal stem cells on these films have been investigated for bone tissue engineering applications. To this end, trabecular part of the bovine tibia was cut and the trabecular part was divided into small pieces. The divided pieces of trabecular bone tissues were decellularized with Trizma.HCI/EDTA, Triton X-100, DNAse, RNAse and peracetic acid, respectively. The decellularized trabecular bone tissues were digested with the pepsin enzyme and neutralized using 10X PBS, 0.1 N NaOH. In our study, 2 different methods were applied to obtain film. The films obtained from the first method were cross-linked using Nhydroxysuccinimide/1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (NHS-EDC). Cross-linking process was not performed to in films fabricated with by the second method. Cellular behaviours of human adipose mesenchymal stem cells on films the produced both two different methods such as adhesion, proliferation and differentiation were studied. For this purpose, histochemical (H&E, Alizarin Red S and von Kossa), immunohistochemical evaluations (osteonectin, osteocalcin) and cellular viability tests (XTT, MTT) were carried out. Human adipose mesenchymal stem cells on the films fabricated with the first method did not penetrate into the film due to the effect of crosslinking. Human adipose mesenchymal stem cells seeded on the film the second method were proliferated by penetrating into the films. DNA content analysis was performed to evaluate the success of the decellularization process. According to DNA content analysis, the amount of double strand DNA was found to be 46.00 ± 1.36 (n = 3) ng/mg dry weight, demonstrating a successful decellularization process. Patch and decellularized trabecular bone tissues were characterized by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), glycosaminoglycan (GAG) and hydroxiproline content analyses. For the patch and decellularized trabecular bone tissue samples, the GAG amount was found to be 4.76 ± 0.97 μg GAG/mg dry weight (n=3) and 5.21 ± 0.24 μg GAG/mg dry weight (n=3), respectively. The hydroxyproline content of the patch and decellularized trabecular bone tissue samples was calculated to be 45.12 ± 13.21 μg/mg dry weight (n=3), 11.54 ± 3.96 μg/mg dry weight (n=3). The physicochemical characterization of decellularized trabecular bone tissue was assessed by thermogravimetric analysis (TGA), dynamic mechanical analysis (DMA) and attenuated total reflection- fourier-transform infrared spectroscopy ATR-FTIR analyses. Considering these results, it is thought that fabricated films have the potential to be used in the field of bone tissue engineering.