Rat implantasyon modelinde hiyaluronik asit reseptörlerinin immunohistokimyasal ve elektron mikroskobik yöntemlerle incelenmesi

Abstract

Hyaluronik asit (HA)'in implantasyon, fertilizasyon, embriyonik kavitasyon, embriyo büyümesi ve doku morfogenezisinde rol oynadığı bilinmektedir. HA'in IVF uygulamalarında embriyo implantasyon oranını arttırdığı ileri sürülmektedir. HA reseptörleri (CD44, CD44s, RHAMM, Versikan) ve Hyaluronan sentetaz (HAS2) HA fonksiyonlarına aracılık etmektedir, ancak HA reseptörlerinin implantasyondaki rolleri tam olarak bilinmemektedir. Bu çalışmada, HA reseptörlerinin implantasyondaki rollerinin incelenmesi amaçlanmıştır.36 adet erişkin dişi sıçan kontrol ve deney gruplarını oluşturmak üzere iki eşit sayıya ayrıldı. Sıçanların vaginal smear ile mensturasyon dönemleri tespit edildi. Kontrol grubunu proöstreus, östrous ve diöstrous dönemlerine ait uterus örnekleri oluşturdu. Deney grubu östroz döneminde çitleşmeye bırakıldı, gebeliğin 4., 5. ve 6. günü Chicago Blue Dye verilerek implantasyon bölgeleri tespit edildi ve uterus örnekleri alındı. Kontrol ve deney grubuna ait doku örnekleri CD44, CD44s, RHAMM, versikan ve HAS2 poliklonal antikorlarıyla immunohistokimyasal teknik kullanılarak boyandı. İmmunorektivite yoğunluğuna göre zayıf, orta ve kuvvetli olarak değerlendirildi. Tüm sonuçlar Mann Whitney istatistik testiyle karşılaştırmalı olarak değerlendirildi. Bu dönemlerdeki uterus epiteli ve pinopodlar ince yapı düzeyinde, transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak değerlendirildi.İmmunohistokimyasal değerlendirmede, HAS2 immunoreaktivitesi, proöstroz döneminde epitelde ve subepitelde östroz ve diöstroza göre artış olduğu, deney grubunda ise desiduada 5. ve 6. günlerde artış olduğu gözlendi. CD44immunoreaktivitesi, proöstroz ve östroz dönemlerinde epitelde diöstroz dönemine göre artış olduğu, deney grubunda ise 5. artış olduğu gözlendi. CD44s immunoreaktivitesi, derin stromada diöstroz döneminde proöstroz ve östroza göre artmış olduğu, deney grubunda ise desiduada 5. ve 6. günlerde artış olduğu gözlendi. RHAMM immunoreaktivitesi, proöstroz döneminde epitel, subepitel, ve derin stromada östroz ve diöstroz dönemlerine göre artış olduğu deney grubunda ise desiduada 5. ve 6. günlerde artış olduğu gözlendi. Versikan immunoreaktivitesi, diöstrozda subepitel ve derin stromada proöstroz ve östroza göre artmış olduğu, deney grubunda ise desiduada 6. günde artış olduğu gözlendi.İnce kesitlerin değerlendirilmesinde, kontrol grubundan proöstroz ve östrozda epitel kalınlığının aynı olduğu, mikrovillusların varlığı gözlendi. Diöstroz grubunda ise mikrovillus sayısının ve epitel kalınlığının belirgin oranda azaldığı ve hücreler arası mesafenin arttığı gözlendi. Deney grubunda gebeliğin 5. gününde bleb oluşumu gözlendi.Deney grubunda ait doku örneklerinde 5. ve 6 gün HAS2, CD44s, RHAMM; 5 gün, CD44 ve 6. günde Versikan immunoreaktivitesinde istatistiksel anlamlı artmış olması; 5 günde elektron mikroskobik olarak epitelde pinopodların gözlenmesi ve silyaların azalmış olması, HA'in implantasyon döneminde önemli rol oynadığının göstergeleri olarak değerlendirildi.

Hyaluronic acid (HA) was known to play a role in fertilization, implantation, embryonic cavitation, embryo growing and tissue morphogenesis. HA suggests increasing embryo implantation rate in IVF applications. HA receptors (CD44, CD44s, RHAMM and versican) [1,2, 3] and HA synthase 2 (HAS2) are mediated HA functions, but the roles of HA arent known exactly on implantation. In this study, we aim to evaluate the role of HA on the implantation process.Thirty-six adult female rats were divided in six groups: as control (proosterus, estrous and diostreus) and experimental groups (after fertilization 4.day, 5. day, 6. day). Menstruation periods were detected with vaginal smear both control group (proestrous, estrous and diestrous) and experimental group. Experimental group animals were mated in the estrous period. Implantation regions of experimental group were determinated with Chicago blue dye and uterine samples were obtained. Tissue samples of both groups were stained with CD44, CD44s, RHAMM, versican and HAS2 polyclonal antibodies using immunohistochemical technique. Immunoreactivity was evaluated as weak, moderate or strong and results were evaluated comparatively using Mann Whitney statistical test. İn this stages, ultrastructure of pinopodes and uterin epithelial evaluate using transmission electron microscope.In evaluation as immunohistochemical, strong HAS2 immunoreactivity of epithelial and subepithelial was observed in proestrous and desidua on 5th, 6th days but moderate in diestrous cycle. Strong CD44 immunoreactivity of endometrial epithelial cells was seen in proestrous and estrous cycle but moderate in diestrous cycle and on 5th day. Strong CD44s immunoreactivity of deep stroma was seen in diestrous and desidua on 5th, 6th days but moderate in proestrous and estrous cycle. Strong RHAMM immunoreactivity of epithelial, subepithelial and deep stroma was seen in proestrous and desidua on 5th, 6th days but moderate in diestrous and estrous cycle. Strong Versican immunoreactivity of subepithelial and deep stroma was seen in diestrous and desidua on 6th day but moderate in proestrous and estrous cycle.In evaluation of thin sections, in proestrous and estrous was increased microvilli but decreased in the diestrous. In experimental group was observed bleb on 5th day.In tissue samples of experimental group, increase as statistical of HAS2, CD44s, RHAMM immunoreactivity in 5th and 6th days; CD44 immunoreactivity in 5th day and Versican immunoreactivity in 6th day, pinopodes in electron microscopy was observed in 5th day and decreased of silial, It was concluded that te HA play a important role during implantation.