Rubia tinctorum L. bitkisinde Agrobacterium rhizogenes aracılığıyla transforme saçaklı kök kütürlerinin oluşturulması ve sekonder metabolit üretimi

Abstract

Bitkisel sekonder metabolitler tıp, gıda, ziraat gibi çeşitli alanlarda kullanılmaktadır. Bunedenle, son yıllarda özellikle doku kültürü teknikleri ile sekonder metabolitlerin elde edilmesiüzerine yapılan çalışmalar hız kazanmıştır.Bitki büyüme hormonları içermeyen ortamlarda biyokimyasal ve genetik açıdanstabiliteye ve hızlı büyüme yeteneklerine sahip olan saçaklı kök kültürleri, tercih edilebilir enuygun doku kültürü teknikleridir. Agrobacterium rhizogenes, birçok dikotiledon bitkide gentransferi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu bakterinin enfeksiyonu sonucunda, kök teşvikedici plazmidin (Ri plazmid) T-DNA'sı, bitki hücresine aktarılır ve genomik (nükleer) DNA'sınaentegre edilir. Enfeksiyon bölgesinde hızlı çoğalabilen ve çok dallı saçaklı kökler oluşur. Bukökler, bazı sekonder metabolitlerin üretimi için önemli bir potansiyele sahiplerdir.Rubia tinctorum L. ?Kök Boya?, halk arasında boyama özelliğinden dolayı çok eskizamanlardan beri halıcılıkta kullanılan, ayrıca diüretik, antispazmodik, antiskorbütik veantibakteriyel özellikleri nedeniyle tıbbi öneme sahip bir bitkidir. Bu tez çalışmasında Rubiatinctorum L. bitkisinin saçaklı kök kültürleri ve sekonder metabolit içerikleri incelenmiştir.Tohumların yüzeysel sterilizasyonlarından sonra, bitkiciklerin mikroçoğaltımları 0.5 mg/lIBA içeren MS (Murashige ve Skoog, 1962) ortamlarında başarılmıştır. Transformasyonçalışmalarında, bitkiciklerin yaprak ve nod eksplantları Agrobacterium rhizogenes' in 4 farklı ırkı(15834, A4, 8196, R1000 ) ile inokule edilmiştir. En yüksek saçaklı kök oluşumu %61.2oranında 15834 ırkı ile inokule edilen nod eksplantlarında belirlenmiştir. Elde edilen saçaklıkökler MS, B5, SH ortamlarında kültüre alınmışlardır. Özellikle MS ortamından elde edilenkökler altın sarısı renginde iken B5 ortamında üretilen köklerin ise kırmızı renkte oldukları veortam renginin de kırmızıya dönüştüğü gözlenmiştir. SH ortamına ait köklerin ise sarımsı ve inceyapıda oldukları saptanmıştır.Farklı ırklar (A4, 8196, R1000) ile oluşturulan saçaklı kök kültürlerindeki sekondermetabolit miktarları HPLC ile belirlenmiştir. En yüksek antrakinon miktarları R1000 ırkı ile eldeedilen saçaklı köklerde lusidin primeverozit 1.13 mg/g; ruberitrik asit 8.4 mg/g; alizarin 0.072mg/g olarak saptanmıştır.Sekonder metabolit miktarını arttırmak için B5 ortamına elisitör olarak metil jasmonat(0.1µM) ve yüksek sukroz (%12) ilaveleri ile çalışmalar yapılmıştır. Metil jasmonat (MeJA)içermeyen, sukroz ilaveli B5 (B5S) ortamında kuru saçaklı kökte lusidin primeverozit, ruberitrikasit ve alizarin miktarları sırasıyla 13.45 mg/g; 93.2 mg/g; 0.78 mg/g olarak tespit edilmiştir.Metil jasmonat ve 120 gr sukroz içeren B5 (B5SMeJA) ortamında da lusidin primeverozit,ruberitrik asit ve alizarin miktarları sırasıyla 12.31 mg/g, 86.8 mg/g, 0.11 mg/g olarakbelirlenmiştir. Doğadan toplanan kökte ise alizarin dışındaki lusidin primeverozit ve ruberitrik asitmetabolitleri, saçaklı köklere göre daha yüksek miktarlarda bulunmuşlardır.Anahtar Sözcükler:Rubia tinctorum, Agrobacterium rhizogenes, saçaklı kök, sekonder metabolit, alizarin

Plant secondary metabolites have been widely used in various sectors; i.e, medicine, food,agriculture. For this reason researches especially on the production of secondary metabolites viatissue culture techniques have been accelerated.Hairy root cultures which have biochemical and genetic stabilities, fast growing abilities inmedia without plant growth hormones are the most suitable and preferable tissue culture techniques.Agrobacterium rhizogenes has been used regularly for gene transfer in many dicotyledonous plants.As a result of the infection of this bacteria, T-DNA of root inducing plasmid (Ri-plasmid) is transfered tothe plant cell and integrated to genomic DNA. The proliferative and multibranched hairy roots areformed in infection regions. These roots have very important potentials in the production of some plantsecondary metabolites.Rubia tinctorum L. `Madder? used by local people in dyeing of carpets with its roots for manyyears has diuretic, antispasmodic, antiscorbutic and antibacterial properties. In this thesis, hairy rootcultures of Rubia tinctorum L. and their secondary metabolites were investigated.After surface sterilization of seeds, micropropagation of plantlets was achieved in MS mediacontaining 0,5 mg/l IBA. In transformation studies, the leaf and nod explants of the plantlets wereinoculated by 4 different strains (15834, A4, R1000, 8196) of Agrobacterium rhizogenes. The highesthairy root occurrence was determined as 61,2% in the nod explants inoculated with 15834 in solid MSmedium. The obtained hairy roots were cultured in liquid MS, B5 and SH media. Especially the hairyroots obtained from MS medium were golden color; the roots from B5 media were red and also thecolor of liquid B5 media turned red. The roots obtained from SH media were yellowish and thin.The amounts of secondary metabolites in hairy roots formed by inoculation with differentstrains (A4, R1000 and 8196) in MS medium were analyzed with HPLC. The highest amounst ofanthraquinones in hairy roots obtained with R1000 strain were determined as 1.13 mg/g for lucidinprimeveroside; 8.4 mg/g for ruberythric acid, and 0.072 mg/g for alizarin.0,1µM methyl jasmonate as an elicitor and high amount of sucrose (%12) were added into B5media in order to increase the amount of secondary metabolite. In the dried hairy roots obtained fromB5 media containing sucrose without methyl jasmonate (B5S), the amounts of lucidin primeveroside,ruberythric acid and alizarin were determined as 13,45 mg/g, 93,2 mg/g and 0,78 mg/g, respectively.The hairy roots belonging to B5 media containing methyl jasmonate and 120 g sucrose (B5SMeJA)the amounts of lucidin primeveroside, ruberythric acid, and alizarin were found as 12,31 mg/g, 86,8mg/g 0,14 mg/g, respectively. In the collected roots from nature, the amounts of lucidin primeveroside,ruberythric acid, except alizarin metabolites were higher than the hairy roots.Key wordsRubia tinctorum, Agrobacterium rhizogenes, hairy root, secondary metabolite, alizarin