SKBR3 meme kanseri hücre hattında zebularinin apoptotik yolakta görev alan kaspaz-3, kaspaz-8, ve kaspaz-9 üzerine olan etkisinin incelenmesi

Abstract

DNA metil transferaz inhibitörü (DNMTi) olan nükleotid analogları apoptoz ile ilişkili genlerin ve metilasyon ile susturulan tümör baskılayıcı genlerin ekspresyonunu yeniden düzenleyebilir. Böylece, tümör hücrelerinde apoptoz oluşumu tetiklenebilir. DNA metil transferaz inhibitörü olan (sitidin analogu) zebularin bu ajanlardan birisidir. Bu çalışmada zebularinin SKBR-3 meme kanseri hücre hattında sitotoksisite ve apoptoz mekanizması üzerine olan etkilerini analiz etmeyi amaçladık ve bu çalışma literatürde bu konudaki ilk çalışma olduğundan önemlidir.Çalışmada kullanılan SKBR-3 hücreleri %10 FBS ve %1 penisilin/streptomisin içeren DMEM besiyerinde uygun kültür ortamında büyütülmüştür. Zebularinin hücre canlılığı, hücre büyümesi, hücre transformasyonu ve hücre göçü üzerine etkilerinin araştırılması için, sırasıyla MTT deneyi, sağkalım deneyi, soft-agar koloni oluşum deneyi ve yara iyileşmesi deneyi gerçekleştirilmiştir. Aynı zamanda, apoptotik mekanizmadaki etkilerini anlamak için, bisülfit modifikasyonu sonrasında metilasyon spesifik HRM (MS-HRM) ile kaspaz-3, kaspaz-8 ve kaspaz-9'un metilasyon analizleri gerçekleştirilmiştir.Elde edilen bulgular neticesinde zebularinin hücre canlılığını, hücre büyümesini (p<0,0001), hücre göçünü (p<0,001) ve hücre transformasyonunu (p<0,001) önemli derecede azalttığı gözlenmiştir. Ayrıca, zebularin 48 saatlik tedavi sonrasında hücre canlılığını %47'ye düşürmektedir. Uygulanan dozda zamanda zebularine SKBR-3 hücrelerinde kaspaz-3, kaspaz-8 ve kaspaz-9 genlerinde metilasyon seviyelerinde önemli değişikliklere neden olmamaktadır. Bu sonuçlar neticesinde zebularinin kemoterapide kullanılabileceğine dair destekleyici sonuçlar elde edilmiştir ve literatürde zebularinin SKBR3 hücreleri üzerine etkilerinin araştırılmasına yönelik yapılan ilk çalışma olması nedeniyle özgün bir nitelik taşımaktadır. Fakat etki mekanizmasının daha iyi bir şekilde anlaşılabilmesi için gelecekteki çalışmalarda kaspaz-bağımlı apoptoz mekanizmasının aydınlatılması gerekmektedir.

DNA methyl transferase inhibitor (DNMTi) nucleotide analogues can reorganize the expression of the genes related to apoptosis and tumour suppressor genes which are silenced by methylation. Thus, it can trigger apoptosis formation in tumour cell. Zebularine which is DNA methyl transferase inhibitor (cytidine analogue) is one of these agents. This study aimed to analyse the effects of zebularine in SKBR3 breast cancer cell line on cytotoxic and apoptotic mechanism and it is important in the sense that it is the first study on the issue in the literature. SKBR3 cell line used in the study is grown at DMEM medium. In order to evaluate the effects of Zebularine on cell viability, cell growth, cell transformation and cell migration, MTT assay, cell survival assay, soft agar colony formation assay, wound healing assay were done respectively. At the same time, in order to understand the effects on apoptotic mechanism, Methylation Sensitive High Resulation Melting (MS-HRM) was done for the methylation analysis of caspase-3, caspase-8 and caspase-9 genes after bisulphite modification. As a result of the findings, it is observed that Zebularine considerably decimates the cell viability, growth (p<0,0001), cell migration (p<0,001) and cell transformation (p<0,001). However, Zebularine shows cell viability at 47% after treatment at 48 hours. At the same time, Zebularine don't cause significant change on methylation in caspase-3, caspase-8 and caspase-9 genes administered dose and time in SKBR3 cells. These results support that Zebularine can be a new anticancer agent in chemotherapy in breast cancer cells and this is the first work on this subject. However, for the understanding of the mechanisms of action, it is necessary to carry out studies aiming at understanding the caspase-related apoptosis mechanism in the future.