Tetrahymena thermophila ligaz enzim ailesi üyelerinden birinin moleküler ve biyoteknolojik karakterizasyonu

Abstract

DNA ligazlar, DNA replikasyonu, tamiri ve rekombinasyonu esnasında meydana gelen DNA kırıklarını tamir ederler. Tüm DNA ligazlar aktif bölgelerinde KxDGxR motifi taşır ve kofaktör ihtiyaçlarına göre NAD ya da ATP bağımlı olup aynı reaksiyon mekanizmasını izler. Tetrahymena thermophila tekhücrelisinde, biyoteknolojik olarak üretilip kullanılan ATP bağımlı T4 DNA ligaz'a alternatif olabilecek bir enzimi belirlemek ve rekombinant olarak üretmek bu tezin amacını oluşturmaktadır. GenBankasında ve Tetrahymena Genom Veritabanınında Tetrahymena thermophila'nın makronüklear genleri içinde yapılan BLAST analizi dört adet DNA ligaz geni bulunduğunu göstermiştir. Bunlardan TtLIG11 ve TtLIG12 adı verilen üyelerin ökaryotik DNA ligaz I, TtLIG4'ün ökaryotik DNA ligaz IV sınıfına dahil olduğu MEGA4 programı kullanılarak filogenetik analizler ile belirlenmiştir. Son üye olan TtLIG13'ün ise T4 gibi virüs ve prokaryotların ligazlarına benzerlik gösteren fakat sadece omurgasızlarda bulunan bir altsınıfa ait olduğu bulunmuş ve bu guruba Ligaz II adının verilmesi önerilmiştir. DNA ligazlara özgü altı motifi taşıyan Tetrahymena DNA ligaz üyelerinden TtLIG13'ün E. coli'de rekombinant protein olarak ifade edilebilmesi için gerekli 22 nokta mutasyonu PZR ile yerleştirilerek kodon uyumu sağlanmıştır. Rekombinant TtLIG13 cDNA'sı 6XHistidin takısını sağlayan pET16b vektörüne klonlanmış ve E.coli BL21 (DE3) pLysS'e aktarılmıştır. Rekombinant TtLIG13'ün ilk IPTG indüksiyonu gerçekleştirilerek Ni-NTA tanecikleri ile afinitik saflaştırılma denemeleri gerçekleştirilmiş fakat toksik gen grubuna girmesinden dolayı zorluklarla karşılaşılmıştır. Rekombinant TtLig13p'nin üretim ve saflaştırma çalışmaları sürmekte olup biyoteknolojik alternatif ürün potansiyelinin değerlendirmesi bu aşamanın başarılı olması durumunda sonuçlandırılabilecektir.

DNA ligases join breaks in the phosphodiester backbone of DNA molecules during DNA replication, repair and recombination. All DNA ligases share the same active site KxDGxR motif, and follow the same reaction mechanism but they may use either ATP or NAD+ as a cofactor. The goal of this study is the recombinant production of an alternative DNA ligase enzyme determinated among Tetrahymena thermophila macronuclear genes alternative to biotechnologically produced ATP dependent T4 DNA ligase. Toffffhe results of BLAST analysis in GeneBank and Tetrahymena Genome Database showed that this unicellular organism contains four ATP dependent DNA ligase genes. According to phylogenetic analysis made by MEGA4 program, TtLIG11 and TtLIG12 ligases are under eukaryotic Ligase I group, TtLIG4 under eukaryotic ligase IV. The last member TtLIG13 located under viral and prokaryotic ATP dependent DNA ligase grup with some invertebrate members and it is proposed in this thesis that this primitive invertebrate ligase group called as Ligase II. To express the TtLIG13 as a recombinant protein in E.coli the necessary codon adaptation was made by the introduction of 22 multiple point mutations with PCR into cDNA protein coding region. Recombinant TtLIG13 cDNA is cloned in to pET16b which provide 6x His taq then transformed to E.coli BL21 (DE3) pLysS. Recombinant TtLIG13 was induced with IPTG and isolation with Ni-NTA beads was implemented but encountered difficulties cause it is a toxic gene. Ones the underway experimental production and isolation of recombinant TtLig13p is successfully accomplished, the evaluation of biotechnological alternative DNA ligase enzyme potential will be finalized.