Çocukluk çağı immun trombositopenik purpurasında transforming growth factor-beta 1 gen polimorfizminin rolü

Abstract

7.ÖZET Amaç: İmmun trombositopenik purpura çocukluk çağında en sık trombositopeni nedenlerinden biridir. ITP'de trombositopeni mekanizması bilinmekle birlikte hastalığın etyolojisi ile ilgili genetik yatkınlık, tetikleyici çevresel faktörler (aşılama, toxinler...), immun sistem gibi faktörlerin hangi hastalarda ve nasıl akut veya kronik ITP gelişmesinde rol oynadığı bilinmemektedir. Akut ve kronik ITP arasındaki klinik ve epidemiyolojik farklılıklar her iki klinik formda da trombositopeni oluşumunda farklı patofizyolojik mekanizmaların sorumlu olduğunu düşündürmektedir. Patogenezde T hücre anormalliklerinin önemli rolü olduğu bilinmekte ve kronik ITP'de IFN-y, IL-2 ve İL- 10' un serum düzeylerinin yüksek saptanması akut ve kronik ITP'nin patogenezinde farklı mekanizmaların rol oynadığını desteklemektedir. Son yıllarda TGF-pl, TNFa, IL-10, IL-6, IFNy gibi sitokinlerin gen polimorfizmleri ile GVHD, SLE, osteoporoz, transplant reddi gibi hastalıklar arasında ilişki gösterilmiş, bazı genotipleri taşıyan kişilerde hastalığın oluşma riskinin arttığı bildirilmiştir. Bu sitokinlerden TGF-Bl hücre gelişmesi, yara iyileşmesi, onkogenez, immunmodulasyon, fibrozis ve ateroskleroz gibi çeşitli fizyolojik ve patolojik olaylarda rolü olan multifonksiyonel bir sitokindir. TGF-j31'in B hücre proliferasyonunu ve antikor üretimini azaltıcı, antijen sunan hücrelerin aktivitesini inhibe edici ve aynı zamanda Thl ve Th2 hücreleri üzerine baskılayıcı özelliğe sahip olduğu bildirilmektedir. Andersen ve arkadaşları, kronik ITP'li hastalarda aktif hastalık döneminde aktive T hücrelerinin arttığını, remisyondaki (trombosit sayısı > 150xl09/L ) hastalarda ise Th3 sitokini olan TGF-(31 serum düzeyinin ve aynı zamanda major TGF-31 kaynağı olan NK hücrelerinin artarak immun yanıtın hastalanmasında önemli rol oynadığını göstermişlerdir. Bu bilgiler ışığında çalışmamızda TGF-J31 gen polimorfizmlerinin ITP gelişmesi, hastalığın klinik seyri ve tedaviye yanıtta risk faktörü olasılığını araştırmayı planladık. Hastalar ve yöntem: En az 6 aydır ITP tanısı ile izlenen 6ay-16yaş grubunda 35 akut ITP, 40 kronik ITP'li çocuk ve 97 sağlıklı çocuk çalışmaya alındı. ITP tanısı öykü, fizik muayene ve periferik kan yayma bulguları ile konuldu. Hasta ve kontrol grubundan 2ml kan örneği %0.1 EDTA'lı steril tüpe alınarak -20 C'de depolandı. Örneklerin toplanması tamamlandıktan sonra kan örneklerinden DNA izolasyonu yapıldı. TGF-01 geni 509(C-»T), Kodon25(Arg->Pro), Kodonl0(Leu->Pro) polimorfizmleri PCR ve enzim kesimleri yapılarak değerlendirildi. 48Bulgular: Akut ITP'li hastaların yaşları 6ay-16yaş (ortanca 6.0 yıl), kronik ITP'li hastaların yaşlan 3yaş-16yaş (ortanca 9.5 yıl) olarak saptanmış ve kronik ITP'li hastaların ortalama yaşlarının istatistiksel olarak anlamlı oranda yüksek olduğu bulunmuştur (p=0.000). Akut ITP'li hastaların tanı sırasında trombosit sayısı ortalama 9.5 ± 6.5 x 109/L (1.0 - 26.0), kronik ITP grubunda 20.0 ± 16.4 x 109/L (1.0 - 78.0) olarak bulunmuştur. Tanı anındaki ortalama trombosit sayısı kronik ITP grubunda, akut ITP grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı oranda yüksek bulunmuştur (p=0.001). Her iki hasta grubunda hemoglobin, ve lökosit sayılan arasında istatistiksel anlamlı fark saptanmamıştır (sırasıyla p=0.588, p=0.474). TGF-pi'in bakılan 509(C->T), Kodon25(Arg-»Pro), Kodonl0(Leu-»Pro) polimorfizmleri genotip sıklığının dağılımı açısından akut ITP, kronik ITP ve kontrol grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık bulunmamıştır (sırasıyla p=0.468 p=0.469, p=0.135). TGF-pl'in 509(C->T), Kodon25(Arg->Pro), Kodonl0(Leu->Pro) polimorfizminlerinin allel sıklıkları açısından da üç grup arasında istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmamıştır (sırasıyla p=0.133, p=0.445, p=0.120). Kronik ITP'li hastaların tedavi yanıtları ile TGF-pl gen polimorfizmleri karşılaştırıldığında sadece Kodonl0(Leu-»Pro) polimorfizmi ile tedaviye yanıt arasında istatistiksel anlamlı fark saptanmıştır (p=0.010). Ancak bu istatistiksel anlamlılık tam yanıtlı hasta grubunda az sayıda olgu olması nedeni ile tartışılabilir. Kısmi yanıtlı hasta grubu ile minimal yanıtlı ve yanıtsız hasta grubu karşılaştırıldığında ise aralarında istatistiksel anlamlı farklılık saptanmamıştır (p=0.337). TGF-pl'in bakılan 509(C-»T), Kodon25(Arg-»Pro), Kodonl0(Leu-»Pro) polimorfizmlerindeki genotip sıklığının ITP'li hasta grubunda kontrol grubuna göre farklı olmaması bu genotiplerin ITP için risk faktörü olmadığını göstermektedir. Sonuç: Sonuç olarak çalışmamızda TGF-pi geninin bakılan üç polimorfizmindeki genotip ve allel sıklığının ITP'li hasta grubunda kontrol grubuna göre farklı olmaması bu genotiplerin ITP gelişimi ve klinik seyri için risk faktörü olmadığını düşündürmektedir. Ancak kronik ITP'de Kodonl0(Leu-»Pro) polimorfizminin tedaviye yanıtta olumsuz risk faktörü olabilir. Hasta sayısının arttırılması ve diğer TGF-pi polimorfizmlerinin çalışılması durumunda farklı bulgular elde edilebilir. 49

8.SUMMARY ROLE OF TRANSFORMING GROWTH FACTOR-01 GENE POLYMORPHISMS IN CHILDHOOD IMMUNE THROMBOCYTOPENIC PURPURA Objective:Immune thrombocytopenic purpura (ITP) is one of the most frequent cause of acquired thrombocytopenia in childhood. Although the mechanism of trombocytopenia in ITP has been known for a long time, etiology of the disease still remains unknown. How the genetic and enviromental factors and immune systems of the patients affect the etiology and the clinical progress of ITP have not been understood yet. Increased activation of T-cells, enhanced cytokine production such as IFN-y, IL-2 and IL-10 in chronic ITP suggest that different mechanisms may operate in the pathogenesis of chronic and acute ITP. Recently, an association between some cytokine gene polymorphisms, such as TGF-J31, IL-10, TNF-alpha, and IL-6 and frequency of several diseases, such as GVHD, SLE, osteoporosis, and allograft rejection have been demonstrated. Among these cytokines, TGF-31 is a multifunctional cytokine that plays a role in cell growth, wound healing, oncogenesis, immunomodulation, fibrosis, and atherosclerosis. TGF-(31 also has a suppressor effect on B-cell proliferation, Th-1 and Th-2 cells, antibody production and an inhibitor effect on activity of antigen presenting cells and on megakaryopoiesis. Andersen et al determined increased serum TGF-(31 levels and enhanced NK cells, which are one of the major sources of TGF-J3I, in patients who are in the remission period of ITP. In our study we aimed to investigate whether TGF-f31 gene polymorphisms have a role on development, clinical progress, and treatment response in pediatric patients with ITP. Methods: Thirty-five children with acute ITP, forty children with chronic ITP and ninety- seven healthy children between 6 months old and 16 years old were enrolled in this study. The diagnosis of ITP was based on past history,physical examination and peripheral blood findings. In all children, blood samples (2ml) were collected into EDTA tubes and genomic DNA was extracted. TGF-01 gene 509(C-»T), codon25(Arg->Pro), codonlO(Leu-»Pro) polymorphisms and alleles were studied by using a coupled polymerase chain reaction-restriction enzyme digestion method. Results: Acute ITP patients were between 6 months old and 13 years old (median 6.0 years old), chronic ITP patients were between 3 years old and 16 years old (median 9.5 50years old). The age of the patients with chronic ITP was significantly older than patients with acute ITP (p=0.000). At the time of diagnosis, mean platelet counts were 20.0 ± 16.4 x 109/L (1.0 - 78.0) and 9.5 ± 6.5 x 109/L (1.0 - 26.0) respectively in chronic ITP and acute ITP groups. Mean platelet counts was significantly high in patients with chronic ITP (p=0.001).The hemoglobin level and leukocyte count did not differ significantly between the acute and chronic ITP groups (respectively p=0.588, p=0.474). The frequencies of TGF-pi 509(C-»T), codon25(Arg->Pro) and codonl0(Leu^Pro) polymorphisms between acute ITP, chronic ITP, and control group did not differ significantly (respectively p=0.468 p=0.469, p=0.135). Also allele frequencies of these groups did not differ significantly ( p=0,133, p=0.445, p=0.120). When patients with chronic ITP were evaluated according to their therapy response, there was a statistically significant difference between codonl0(Leu-»Pro) polymorphism and therapy response (p=0.010). This significance was found suspicious, because there were only few patients having codonl0(Leu-»Pro) polymorphism in the good responder group and there was no statistically significant difference between the partial responders and minimal or nonresponders (p=0.337). Conclusions: Our results demonstrated that the frequency of TGF-(31 gene 509(C-»T), codon25(Arg-»Pro) and codonl0(Leu-»Pro) polymorphisms and alleles do not play a role as a genetic risk factor in development and clinical progress of ITP. On the other hand, TGF-J31 gen codonl0(Leu->Pro) polimorphisin may be a negative risk factor in treatment response. Different results may be obtained with further studies involving larger patient populations and other TGF-Plgene polymorphisms. 51