Formalin ile fikse edilmiş ve parafine gömülmüş dokulardan PCR için DNA ekstraksiyonu

Abstract

I. ÖZET Patoloji laboratuvarlannda korunan dokularda DNA izole etmek, retrospektif çalışmaların yapılabilmesi açısından önemlidir. Bu amaçla çeşitli izolasyon yöntemleri geliştirilmiştir. Parafine gömülmüş dokulardan izole edilen DNA çok fazla kırılmış olduğundan `Southern blot` ve `RFLP` yöntemleri için yeterince uygun değildir. Son yıllarda nükleik asit amplifikasyonu, viral genom belirlenmesi, gen düzenlenmeleri ve gen ekspresyonunun saptanmasında yoğun olarak kullanılmakta olan PCR yöntemi bu yönden üstünlüğe sahiptir ve direkt analizde kolaylıkla uygulanabilmektedir. Formalin ile fikse edilmiş ve parafine gömülmüş dokulardan DNA izole etmek ve izole edilen DNA'ların PCR'da uygun olup olmadığını araştırmak için yapılan bu çalışmada Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı arşivindeki dokular seçildi. 1992 yılına ait dokulardan iki grup, 1993 yılına ait dokulardan üçüncü bir grup oluşturuldu. Bütün gruplarda sindirim tamponu ile DNA ekstraksiyonunu içeren Wright 'm yöntemi çeşitli modifikasyonlar yapılarak uygulandı (39). Üçüncü grupta hem modifiye Wright hem de DNA ekstraksiyonu ve purifikasyonunu içeren Forsthoeful yöntemi çeşitli modifikasyonlar yapılarak uygulandı (14). Kolorektal karsİnomlu dokulardan oluşan üçüncü grupta, iki izolasyon yöntemi ile elde edilen DNA'lar üzerinde c-Ki-ras onkogeninin 135 nükleotidlik bölgesinin PCR'la amplifikasyonu denendi. Bütün gruplardan DNA'nın izole edildiği, spektrofotometrik ve elektroforetik değerlendirme ile gösterildi. Ayrıca elde edilen DNA örneklerinin PCR için uygun olduğu, c-Ki-ras onkogeninin 135 nükleotidlik bölgesinin amplifikasyonunun gerçekleştirilmesi ile gösterildi. Sonuç olarak formalin ile fikse edilmiş ve parafine gömülmüş dokulardan elde edilen DNA'nın PCR reaksiyonunda kullanılabileceği ve en iyi PCR sonuçlarının modifiye Forsthoeful yöntemi ile elde edildiği belirlendi. -1-

II. ABSTRACT Possibility of DNA isolation from preserved human tissue in Pathology laboratories would provide numerous experimental opportunities including the retrospective investigations. Various isolation techniques are developed for this purpose. The DNA isolated from paraffin embeded tissue is usually highly fragmented and can not be sufficiently used for Southern blot or Restricsion fragment lenght polmorfism (RFLP) analysis. In this respect, Polymerase Chain Reaction (PCR) which is recently used intenselly for the purposes of, detecting viral genom, oncogene mutations, gen rearrangements, and gene expressions, has a superiority related to the other methods mentioned above, and easily be used for direct analysis. In this study, we planned to isolate the DNA from formalin-fixed and paraffin-embedded tissue and to demonstrate its convinience for the PCR. For this purpose, we choose the tissue from the archives of Dokuz Eylül University Pathology Department. Two grups were chosen from the sepcimens of 1992, third grup was chosen from the sepcimens of 1993. In all the grups, the modified Wright's method (39) acquiring the digestion buffer extraction was applied with slight modifications. Both the modified Wright and modified Forsthoeful methods were slightly modified according to our laboratory conditions. In the third group, which was composed of colorectal carcinoma tissues, PCR amplification of 135 nucleotid reqion of c-Ki-ras oncogene was tested. In addition, to the confirmation of DNA isolation by sectrophotometric and electrophoretic evaluations, the suitability of isolated DNA for PCR was tested by the amplification of 135 nucleotid reqion of c-Ki-ras oncogene. As a result, we concluded that the DNA isolated from formalin-fixed - paraffin-embedded specimens was suitable for PCR and the best results were taken from Forshoeful method. -2-