Sığır kalp dokusunda mitokondrial F0F1-ATP sentaz ve f1-ATPaz enzimlerinin izolasyonu, purifikasyonu ve rekonstitüsyonu

Abstract

59 2.4 ÖZET FgF^ATP sentaz; H+ATP sentaz, H+ATPaz, ATP sentaz ya da kompleks V olarak da adlandırılan, ATP oluşturmak için membranlararası proton gradiyentini kullanan çok altbirimli bir komplekstir. F0F.,ATP sentaz kompleksi iki bölümden oluşur: F,oIarak adlandırılan kısmı ATP sentezinin yapıldığı katalitik kısımdır, memranda bulunan bölge ise enerji iletiminden sorumlu olan F0 bölgesidir. Bu enzimin, ATP sentezleyebilmek için membranlararası proton gradientini enerjiye nasıl çevirdiği bilinmemektedir. Enzim kompleksinin F0 ve F1 kısımları birbirinden ayırılıp,ayrı ayrı fonksiyonları incelenebilir. F1 kısmı membrandan kolaylıkla serbestleştirilebilir. F1 çıkarıldıktan sonra molekülün membranda kalan kısmı proton kanalı olarak isimlendirilen F0'dur. Çalışmamızda sığır kalbi mitokondrisinden F0F,,-ATP sentaz ve Ft-ATPaz enzimlerini saflaştırdık. öncelikle, sığır kalbinden mitokondri, mitoplast ve submitokondriyal partiküller izole edilerek, F^-ATP sentaz enzimi heptil- tiyoglukozid ile çözünür hale getirildi. Bu basamaktan elde edilen materyal anyon-değişim HPLC'ye uygulandı ve F^-ATP sentaz enzimini içeren fraksiyonlar toplanarak konsantre edildi. HPLC basamağı ATPaz'ın spesifik aktivitesini artırdı. Bu aktivitenin olgomisinle inhibasyonu ise bize saflaştırılan enzimin intakt olduğunu göstermektedir. Konsantre edilen materyal SDS-üre- PAGE ile analizlendi. F0F.,-ATP sentaz'ın altbirim kompozisyonu ve molekül ağırlıkları a-48.000, p-45.000, P'(Factor B)-44.000, y-33.800, altbirim b-27.000, OSCP-24.000, 8-20.400, altbirim d- 17.000, F6-13.000, A6L-1 1.500 and altbirim c- 8.000 dalton. FQF1 ATP sentaz'ın molekül ağırlığı ise 477.700 dalton olarak bulundu. Bu çalışmada aynca, sığır kalbinden kloroform-yöntemi ile F1 ATPaz enzimi de saflaştınldı. Kloroformla-serbestleştirme yöntemine göre izole edilen F.,ATPaz enziminin spesifik aktivitesi başlangıç materyali olan iç membran veziküllerine göre 22 kat artmış bulundu. Saflaştırılan F^ATPaz, SDS-üre-PAGE ile analizlendi. F, ATPaz'ın altbirim kompozisyonu ve molekül ağırlıkları a-46.000, 0-44.500, P'(Factor B)-42.600, y-33.000, 8-21.800, IF1-1 1.700, and e-7.500 dalton olarak belirlendi. Başlangıç materyali olarak Mg-ATP partiküllerini kullandığımız için `inhibitor faktör`ü de tayin edildi. F,-ATPaz'ın molekül ağırlığı 347.000 dalton olarak bulundu. Son olarak; DES, oligomisin, ventürisidin ve DCCD'nin F,, rekonstitüe F^, ve pürifiye F0F, üzerinde gösterdikleri inhibitor etkilerini incelendi.

60 2.5 SUMMARY F0FrATP synthase, which is also called H+ATP synthase, FFATPase, ATP synthase, or complex V, is a multisubunit complex that utilizes a transmembrane proton gradient to form ATP. The F0F,-ATP synthase complex is composed of two domains: a hydrophilic part called F,, which is the catalytic site of ATP synthesis, and a membranous domain called F0, which is responsible for energy transduction. However, it is still unknown how this enzyme converts transmembrane proton gradient into energy for ATP synthesis. The F0 and Ft domains can be separated and their functions studied as autonomous entities. The F, portion can be easily dissociated from the membrane and is soluble in aqueous buffers lacking detergents. The portion of the molecule remaining in the membrane after removal of F, is F0, often termed the proton channel. In the present work, we purified F0Fj ATP synthase and Fj-ATPase from bovine heart mitochondria. Firstly, bovine heart mitochondria, mitoplasts and submitochondrial particles were isolated and F0F,ATP synthase was solubulized with HTG from submitochondrial particles. The solution from the previous step was applied to anion-exchange HPLC and fractions containing F0F,ATP synthase were collected, and concentrated. The HPLC step was very effective for increasing the specific activity was completely inhibited by oligomycine, indicating that the purified F^ATP synthase was intact. The concentrated material was analyzed by SDS-urea-PAGE. The subunit composition and molecular weights of F0F,ATP synthase were found as: a-48.000, p-45.000, P'(Factor B)-44.000, y-33.800, subunit b-27.000, OSCP-24.000, 8-20.400, subunit d- 17. 000, F6-13.000, A6L-1 1.500 and subunit c-8.000 dalton. The molecular weight of FJFjATP synthase was also found as 477.700 dalton. We also purified F,-ATPase from bovine heart mitochondria by chloroform-method. The bovine heart F,-ATPase isolated by chloroform-release protocol showed a 22-fold increase in specific activity starting from purified inner membrane vesicles. The purified F,-ATPase was analyzed with SDS- urea-PAGE. The subunit composition and molecular weights of F,-ATPase were found as: a-46.000, p-44.500, p'(Factor B)-42.600, y-33.000, 8-21.800, IF1-1 1.700, and e-7.500 dalton. The molecular weight of Fj-ATPase was found as 347.000. Since we used the Mg-ATP particles as the starting material, we could also determine the inhibitor factor. Finally, we investigated the inhibitory effects of DES, oligomycin, venturicidine and DCCD on F,, reconstitued F0F, and purified F0Fr