İnsan polimorfonükleer lökosit glikojen sentaz enziminin saflaştırılması ve kültür ortamında enzim aktivitesinin değerlendirilmesi

Abstract

ÖZET İNSAN POLİMORFONÜKLEER LÖKOSİT GLİKOJEN SENTAZ ENZİMİNİN SAFLAŞTIRILMASI VE KÜLTÜR ORTAMINDA ENZİM AKTİVİTESİNİN DE?ERLENDİRİLMESİ Hülya AKHUNLAR Glikojen sentaz (EC 2.4.1.1 1 ), glikojen sentez hızını belirleyen reaksiyonu katalizleyen bir enzimdir. Memeli kas ve karaciğer örneklerinden saflaştırılan glikojen sentaz enzimi, gerek yapısal özellikleri, gerekse yapı-fonksiyon ilişkileri yönünden ayrıntıları ile araştırılmıştır. Memeli PMN lökositlerindeki glikojen sentaz enzimi ile ilgili çalışmaların sayısı oldukça yetersizdir. İnsan kan hücrelerindeki glikojen metabolizması enzimlerinin incelenmesi, glikojen depo hastalıklarının tanısında büyük bir kolaylık sağlama potansiyelindedir. Bu çalışmada amaçlanan; insan PMN lökositlerinden, glikojen sentaz `D` ve `I` formlarının saflaştırılması, bazı moleküler özelliklerinin belirlenmesi ve kültür koşullarının, lenfosit glikojen sentaz aktivitesi üzerine etkilerinin incelenmesidir. İnsan PMN lökositlerinden glikojen sentaz `D` ve `I` formunun saflaştırılması; glikojen- enzim kompleksinin affinite kromatografisi ile ayrımlanmasından sonra, endojen glikojenin amilaz ile parçalanması, jel filtrasyonu ve DEAE-Selüloz iyon değiştirici kromatografi tekniklerinin kullanılması ile gerçekleştirildi. Saflaştırma işlemleri sonunda glikojen sentaz `D` ve `I` formlarının spesifik aktiviteleri sırasıyla 12.0 ve 8.2 U/mg protein olarak bulunmuştur. Her iki enzim formunun (D ve I) alt birimleri molekül kütleleri, SDS-PAGE ile 88 ve 82 kDa olarak belirlenmiştir. Bu çalışmaya ek olarak, tüm kandan izole edilerek kültür ortamında çoğaltılmış olan lenfositlerdeki glikojen sentaz aktivitesinin, tüm kandan izole edilmiş olan lenfositlerdeki aktiviteyi yansıttığı saptanmıştır (p>0.05). Yapılan çalışma, saflaştırma işlemlerinin gerçekleştirilmesi için bir temel oluşturacağı gibi, glikojen depo hastalıklarının kesin tanısında kullanılan karaciğer ve kas biopsileri gibi invaziv yöntemler yerine, tekrarlanabilirliği olan ve daha kolay elde edilebilen kan örneklerinin kullanılması ile tanıya yardımcı olacaktır. Lenfosit kültür çalışmalarının da, daha ileri kültür çalışmalarına bir temel oluşturacağı düşünülmektedir. Özellikle de başta çeşitli neoplazmalar olmak üzere, karbohidrat metabolizma bozuklukları olan olgularda ve diabetiklerdeki glikojen metabolizması araştırmalarında kullanıldığı bildirilen, diğer doku kültürleri yerine, aynı araştırmaların daha kolay kültüre edilebilen lenfositler ile yapılmasına olanak sağlayacaktır. Anahtar Sözcükler : Glikojen sentaz-izolasyon - ve - saflaştırma, PMN lökositler-enzimoloji, kültüre lenfositler - ve - enzim aktivitesi.

SUMMARY PURIFICATION OF GLYCOGEN SYNTHASE FROM HUMAN POLYMORPHONUCLEAR LEUKOCYTES AND EVALUATION OF ENZYME ACTIVITY IN CULTURE MEDIUM Hülya AKHUNLAR Glycogen synthase (EC 2.4.1.11) is an enzyme that catalyzes the rate-determining reaction in glycogen synthesis. Glycogen synthase which is purified from mammalian muscle and liver samples has been investigated according to structural properties or structure-function relation. The studies about glycogen synthase in human PMN leukocytes are insufficient. The study of glycogen - metabolizing enzymes in human blood cells has been particularly rewarding for the diagnosis of glycogen-storage diseases. The aim of this study is purification of `D` and `I` forms of glycogen sythase from human PMN leukocytes, determination of the molecular properties and investigation of the effect of culture medium on the activity of lymphocyte glycogen synthase. Purification of `D` and `I` forms of glycogen synthase from human PMN leukocytes is carried out by the techniques involving affinity chromatography of the glycogen-enzyme complex, digestion of endogenous glycogen by amylase, jel filtration and ion-exchange chromatography on DEAE-Cellulose. The specific activities of `D` and `I` forms are found as 12.0 and 8.2 U/mg protein respectively as a result after the purification procedure. The molecular weight of glycogen synthase subunits (D and I forms) is determined as 88 and 82 kDa respectively by SDS-PAGE. We also demonstrated that human lymphocytes which were isolated from whole blood than proliferated in culture medium have the same glycogen synthase activity of isolated lymphocytes from whole blood (p>0.05). This study will constitute a base for realization of purification procedures and also will help for the diagnosis of glycogen storage disease by using available blood samples repeatedly instead of invasive methods such as liver and muscle biopsy. Lymphocyte culture study will be a base for further culture studies. Specially for various neoplazms, for investigation of glycogen metabolism in the cases with carbohydrate disorders and diabetics, this study will give the opportunity to make the same investigations with more easily cultured lymphocytes instead of other tissue cultures. Key Words : Glycogen synthase-isolation - and - purification, PMN leukocytes-enzymology, cultured lymphocytes - and - enzyme activity.