İnsan endotel hücre kültürlerinde değişen L-glutamin konsantrasyonlarının nitrik oksid sentezine etkisinin incelenmesi

Abstract

ÖZET İNSAN ENDOTEL HÜCRE KÜLTÜRLERİNDE DEĞİŞEN L-GLUTAMİN KONSANTRASYONLARININ NİTRİK OKSİD SENTEZİNE ETKİSİNİN İNCELENMESİ Rahim VAHABİ YAGHMOORAALİ Günümüzde rutin olarak doku veya organ parçalarının hücre komponentlerine ayırımları yapılabilmektedir. Tek tip olan bu hücreler saflaştırılabilmekte, biyokimyasal analiz ve hücre kültürü yapımında kullanılabilmektedir. Pek çok hayvan ve bitki hücresi, kültür kaplarında uygun besi ortamı ve büyüme faktörleri sağlandığı takdirde, çoğaltılabilmektedir. Hücrelerin kültür yoluyla homojen bir populasyonu elde edilmekte ve sayılarım artırmak mümkün olmaktadır. Hücre proliferasyonunda konfluens oluştuktan sonra güçlü bir inhibisyon söz konusudur. Endotel hücre kültürleri kontakt inhibisyon ve büyümedeki yoğunluğu nedeniyle iyi bir model oluştururlar. Pek çok hastalıkta, canlı ile çevresi arasındaki ilişkinin araştırma sonuçlan çelişkili iken, doku-hücre kültürü in vitro çalışmaları en iyi sonuçları vermektedir. Endotelden köken alan damar gevşetici faktör veya diğer adıyla nitrik oksid, damar endotelinden asetilkolin ve bradikinin gibi çeşitli faktörlere vazodilatör yanıt olarak salgılanan gaz şeklinde serbest inorganik bir kimyasal türdür. Nitrik oksidin stabilitesinin çok az olması nedeniyle, stabil oksidasyon ürünleri olan nitrit ve nitrat, nitrik oksid hakkında bilgi vermektedir. Bu çalışmanın amacı, kültür ortamına değişen miktarlarda konulan A23187 (bir kalsiyum iyonoforu), bradikinin (reseptör aracılı bir vazodilatör), kalsiyum oksid (ortamı Ca4-1` ile zenginleştiren) bileşiklerinin değişen glutamin düzeylerine sahip kültür ortamlarında nitrik oksid sentezini olası ne şekilde etkilediğinin incelenmesidir. Deney materyali olarak seçilen insan göbek kordonundan endotel hücre kültürü yapıldı. Nitrit ve nitrat düzeyi nitrat 1redüktaz enzimi aracılığıyla ve Griess reaksiyonuna dayalı spektrofotometrik yöntem kullanarak saptandı. Aynı koşullarda arginin, glutamat, aspartat amino asid miktarlan otomatik amino asid analizörü ile belirlenerek bu amino asidler ve NO sentezi arasındaki ilişki incelendi. Kültür ortamı ve ortam + hücre içeriği aracı madde olmadan, L-glutaminin artan konsantrasyonlarında nitrit, nitrat değerleri arasında fark istatiksel olarak anlamlı düzeyde (P <0.05) ve azalma yönünde saptandı. L-glutaminin (0.5, 1 ve 2 mM) artan konsantrasyonlarında ve A23187, bradikinin ve A23187 + bradikirıinin (İve 2 (aM) varlığmda kültür ortamı ve ortam + hücre içeriğindeki nitrit, nitrat değerleri arasında anlamlı (P<0.05) düzeyde azalma saptandı. L-glutaminin artan konsantrasyonlarında CaO ve bradikinin + CaO'in 0.5 ve 1 uM düzeylerinde nitrit, nitrat değerleri arasındaki fark anlamsız (P>0.05) bulunurken 2 uM düzeyinde anlamlı fark belirlendi (P<0.05). Bu sonuçlar, L-glutaminin artan konsantrasyonlannm, 1 ve 2 /xM düzeyde A23187, bradikinin varlığında Arginin - Nitrik oksit yolundaki nitrik oksid sentezini azaltığım, CaO'in 0.5 ve 1 (j,M düzeylerinde rol oynamadığım göstermektedir. Anahtar sözcükler: İnsan kordonu endotel hücre kültürü, L-glutamin, A23187, Bradikinin, NO sentezi.

SUMMARY THE EFFECT OF DIFFERENT CONCENTRATIONS OF L- GLUTAMINE TO NITRIC OXIDE SYNTHESIS IN HUMAN UMBLICAL CORD ENDOTHELIAL CELL CULTURES RAHIM VAHABI YAGHMOORAALI Today tissue or organ parts can be separated to cell components routinely. These cells can be purified; biochemical analysis and cell cultures can be done. Many animal or plant cell with necessary culture medium and growth factors can be grown. With cell cultures a homogen population can be reached and can be grown in multiple of generations. After a confluence a strong inhibition is reached in cell proliferation. Endothelial cell cultures with intact inhibition and with growth density are good models. In many diseases, there is a controversy in research of the living and its environment but tissue - cell culture research in vitro has better results. Endothelial derived vessel vazodilation factor or with the other name nitric oxide, is a free inorganic chemical in gas phase, derived from vessel endothelium as a vasodilatator answer to acetylcoline and bradykinin. Since stability of nitric oxide is very weak, we can get some information with its stable oxidation products, nitrite and nitrate. The aim of our study is to investigate the effects of different concentrations of A23187 (a calcium ionophore), bradykinin (a vasodilation factor), and calcium oxide (Ca2+ ion source) in endothelial cell culture medium with different L-glutamine levels to nitric oxide synthesis. We used human cord endothelial cells for endothelial cell culture. Nitrite and nitrate levels were determined spectrophotometrically, by the use of nitrate reductase enzyme based on Griess reaction. Arginine, glutamate and aspartic acid levels are detected with an automated amino acid analyzer and the effects of these amino acids to NO synthesis is studied with culture medium and culture medium + endothelial cell cytoplasm without any mediator 3substance. As L-glutamine levels increased we found a statistically significant decrease in nitrate and nitrite levels (P<0.05). As we increased L-glutamine (0.5, 1 and 2 mM), in the presence of A 23187, bradykinin, A 23187 + bradykinin we found a statistically significant (PO.05) decrease in culture medium and culture medium + cell cytoplasm nitrite and nitrate levels. As we increased L-glutamine levels (0.5, 1, 2 mM) in CaO, bradykinin + CaO groups there was a statistically significant decrease in nitrite and nitrate levels at 2 mM L-glutamine levels (P<0.05), however no difference at 0.5 and 1 mM levels (P>0.05). As a result as L-glutamine increase in concentration, 1 and 2 uM A23187 and bradykinin decrease the nitric oxide synthesis in Arginine - Nitric oxide pathway and CaO ( 0.5, luM) levels has no effect on the pathway. Key words: Human cord endothelial culture, L-glutamine, A23187, bradykinin, NO synthesis.