Antiinflamatuvar sitokinlerin, nörotrofik faktörlerin ve İnterferon-beta`nın fare oligodendrositlerinin in vitro apoptotik ölümü üzerine etkileri

Abstract

10 l.ÖZET Antiinflamatavar sitokinlerin, nörotrofik faktörlerin ve interferon-beta'nın fitre oligodendrositlerinin in vitro apoptotik ölümü üzerine etkileri Dr. Kemal Kürşad GENÇ Giriş ve Amaç : Oligodendrositler (OL) miyelin yapımından sorumlu glial hücrelerdir. Akut ve kronik nörodejeneratif hastalıklarda OL basan ve apoptotik ölümü görülmektedir. Bu nedenle in vitro değişik hücre hasan modelllerinde OL ölümünü önleyebilecek ajanların belirlenmesi bu hastalıklar için etkin tedavi yöntemlerinin bulunmasına katkıda bulunabilir. Bu amaçla, bu tez çalışmasında interferon-gamma (IFNy), tümör nekrozis faktör-alfa (TNFa), lipopolisakkarid (LPS) ve serum deprivasyonu (SD) ile oluşturulan OL ölümüne karşı interferon-beta (IFNŞ), transforming growth fektör-beta (TGFP), hepatosit growth fektör (HGF), nerve growth fektör (NGF) ve eritropoetinin (EPO) koruyucu etkisinin bulunup bulunmadığı araştırıldı. Gereç ve Yöntemler : Bu çalışmada yenidoğan fere OL ve N20.1 immatür OL hücre hattı kültürlerinde hücre hasan 100 U/ml IFNy + 100 ng/ml TNFa, 100 U/ml IFNy + 1 ug/ml LPS ve SD ile oluşturuldu. OL hasarının ve test edilen maddelerin olası koruyucu etkinliğinin değerlendirilmesinde 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) hücre canlılık ve Laktik dehidrogenaz (LDH) sitotoksisite testleri, apoptotik hücre ölümünün değerlendirilmesinde ise apostain immünfloresan (IF) boyaması kullanıldı. Hücre kültürlerinde EPO reseptörü (EPOR) ekspresyonu EF boyama, Western blotting (WB)- immünpresipitasyon (IP) ve reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) yöntemleriyle değerlendirildi Sonuçlar : Bu çalışmanın sonuçlan uygulanan hücre hasan modellerinde IFNp, TGFp/ HGF ve NGF'ün OL'i koruyucu etkisinin olmadığını, EPO'in ise OL'i koruyucu etki gösterdiğini ve apoptotik hücre ölümünü önlediğini gösterdi IF boyama ile OL'in bazal EPOR ekspresse ettiği, WB-BP ve RT-PCR teknikleriyle N20.1 hücrelerinin hem EPOR proteini hem de EPOR mRNA ekspresse ettiği saptandı. N20.1 hücrelerinde EPOR mRNA ekspresyonunun IFNy ve LPS uygulamalarıyla indüklendiği gösterildi11 Tartışma : Bu sonuçlar çalışmada test edilen maddelerden EPO'in çeşitli in vitro hasar modellerinde OL hasarım ve apoptotik hücre ölümünü önlediğini ve OL'de bazal ve inflamatuvar uyaranlarla indüklenebilir EPOR protein ve mRNA ekspresyonunun bulunduğunu göstermektedir. Bu çalışma daha önceki çalışmalarla çeşitli in vivo hastalık ve in vitro hasar modellerinde nöroprotektif etkisi gösterilmiş olan EPO'in oligodendroglioprotektif etkisini gösteren ilk in vitro çalışmadır. Bu sonuçlar kronik anemi tedavisi endikasyonuyla zaten klinik kullanımı bulunan EPO'in, OL ölümü ve beyaz cevher hasan görülen stroke, travma gibi akut ve multipl skleroz, Alzheimer hastalığı gibi kronik nörodejeneratif hastalıkların tedavisine katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir. Anahtar sözcükler : Oligodendrosit; apoptoz; eritropoetin; nörotrofik faktörler; interferon-beta; anti-inflamatuvar sitokinler; fere

12 2. İNGİLİZCE ÖZET The effects of anti-inflammatory cytokines, neurotrophic factors and interferon- beta on in vitro apoptotic death of murine oligodendrocytes Dr. Kemal Kürşad GENÇ Background, purpose, aim of the study : Oligodendrocytes (OL) are glial cells that are responsible for myelin production. OL injury and apoptotic cell death occur in acute and chronic neurodegenerative disorders. Therefore, determining the agents that may prevent OL death in various injury models in vitro might contribute to establish effective treatment strategies for these disorders. For this purpose, in the present study it has been investigated that whether interferon-beta (IFNP), transforming growth factor-beta (TGFp), hepatocyte growth iâctor (HGF), nerve growth actor (NGF) and erythropoietin (EPO) have protective action against OL death that is induced by interferon-gamma (IFNy), tumor necrosis actor- alpha (TNFa), Hpopoh/saccharide (LPS) and serum deprivation (SD). Material and methods : In this study, OL injury has been induced by 100 U/ml IFNy + 100 ng/ml TNFa, 100 U/ml IFNy + 1 jig/ml LPS and SD in neonatal mice OL and N20.1 immature OL cell line cultures. The OL injury and the possible protective actions of candidate agents have been evaluated by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yI)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) cell viability assay and Lactic dehydrogenase (LDH) cytotoxicity assay. Apostain immunofluorescein (IF) staining has been used for the evaluation of apoptotic cell death. The protein and mRNA expression of EPO receptor (EPOR) has been searched by IF staining, Western blotting (WB)-Immunoprecipitation (IP) and Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) techniques respectively. Results : The results of the present study shows that IFNp/ TGFp/ HGF and NGF have no protective action in the injury models that have been used. In contrast to this, EPO shows protective action on OL and prevents apoptotic cell death. It has been demonstrated that OL expresses baseline EPOR as shown by IF staining and N20.1 cells express both EPOR protein and EPOR mRNA as shown by WP-IP and RT-PCR techniques respectively. It has been shown that EPOR mRNA expression is induced by IFNy and LPS treatment of cultures.13 Discussion : These results show that EPO which is one of the agents that have been tested in this study prevents cell injury and apoptotic cell death in various in vitro cell injury models and that baseline and inflammatory stimuli-induced EPOR protein and mRNA expression exist in OL. This is the first in vitro study that presents the oligodendroglioprotective action of EPO which of the neuroprotective action has been demonstrated by recent studies in various disease models in vivo and injury models in vitro. These results suggest that EPO that is currently used for the treatment of chronic anemia might contribute to the treatment of acute and chronic neurodegenerative disorders such as stroke, trauma, Alzheimer's disease and multiple sclerosis which in OL death and white matter injury occur. Keywords : Oligodendrocyte; apoptosis; eritropoietin; neurotrophic factors; interferon-beta; anti-inflammatory cytokines; mouse