Hepatit B virus genotiplerinin S geninin nükleotid dizi analizi ve RFLP yöntemleri ile belirlenmesi

Abstract

1. ÖZET Hepatit B virus genotiplerinin S geninin nükleotid dizi analizi ve RFLP yöntemleri ile belirlenmesi Anahtar Sözcükler : HBV, Genotip, PZT, RFLP Hepatit B virus (HBV) infeksiyonları ülkemiz açısından önemli bir sağlık sorunu olmasına karşın, genotip dağılımına ilişkin yeterli veri yoktur. Bu tez çalışmasında, laboratuvarımızda HBV-DNA olumlu bulunan 23 örnekte DNA dizi analizi ve RFLP yöntemleri ile genotiplendirme yapılmıştır. Bu amaçla serum örneklerinden proteinaz - K / fenol- kloroform yöntemi ile ekstrakte edilen HBV-DNA dizileri ` S ` genine özgü öncüller kullanılarak PZT yöntemi ile çoğaltıldı. Toplam 541 nükleotidlik bir bölgenin (256-796) çoğaltıldığı bu tepkimenin analitik duyarlılığı 19 kopya /mL olarak belirlendi. Etanol çökeltme yöntemi ile saflaştırılan PZT ürünleri `Sequitherm Excel II DNA Sequencing` kiri ve LI-COR dizileme aygıtı kullanılarak dizilendi. Bu yolla 356 ile 775. pozisyonlar arasında kalan 420 bazlık diziler elde edildi. Bu diziler, Gen-Bank'ten elde edilen ve genotipleri belli diziler ile evrimsel uzaklıkları açısından karşılaştırılarak, `Neighbour- Joining` yöntemi ile filogenetik ağaç oluşturuldu. Bu analiz sonucu, incelenen 23 örneğin tamamının genotip D içinde kümelendiği görüldü. Bilgisayar yardımı ile diziler aminoasit koduna çevrilerek HBsAg subtipleri belirlendi. Yirmibir örnekte ayw2, iki örnekte ise ayw3'e uyan diziler saptandı. Diğer yandan, dizileme yaklaşımlarının zaman alıcı ve pahalı olması gözönüne alınarak epidemiyolojik çalışmalara uygun, hızlı ve kolay uygulanabilir bir RFLP yöntemi geliştirildi. Bu amaçla Gen-Bank'ten elde edilen ve genotipleri belli 68 HBV-DNA dizisinde 256-796. pozisyonlar arasındaki bölgenin restriksiyon haritalaması yapıldı. Elde edilen veriler ışığında Mva I, Rsa I ve Hinf I enzimlerinin tek ve birarada kullanılması ile oluşan restriksiyon kalıplan belirlendi. Çalışmaya alman 23 serum örneğinin tamamında genotip D'ye özgün kalıplar saptandı.

2.SUMMARY Analysis of S gene nucleotide sequence of hepatitis B virus genotypes and determining them with RFLP methods Key Words : HBV, genotype, PCR, RFLP Although hepatitis B virus (HBV) infections are a major health problem in Turkey, there is a little information on the genotype distribution of the virus. In this study, DNA sequencing and RFLP methods were used to genotype 23 HBV-DNA positive samples originating from Turkey. HBV-DNA was extracted by proteinase k / phenol-chloroform method and 541 nucleotide fragment between positions 256 and 796 was amplified using 'S' gene specific primers by single-step PCR. The analytical sensivity of the procedure was 19 copy/mL. PCR products purified by ethanol precipitation were then used in sequencing reactions utilizing `Sequitherm Excel II DNA Sequencing` kit and a LI-COR sequencing apparatus. A 420 bp fragment of the S gene between nucleotide positions 356 and 775 was sequenced and aligned with a data set of 19 HBV S gene sequences available from Gen-Bank. Phylogenetic trees were reconstructed using a neighbour-joining method. All samples were clustered with genotype D sequences. A RFLP based genotyping assay using Mva I, Rsa I and Hinf I enzymes were developed as an easier and less expensive alternative to sequencing. The results of the RFLP analysis of the samples were consistent with the phylogenetic analysis.