Karsinomalı ve normal akciğer doku fibroblast kültürlerinde bazik fibroblast büyüme faktörü(bFGF)`nün kollagen ve matriks metalloproteinaz-2 (MMP-2)düzeyleri üzerine etkisi

Abstract

ÖZET KARSINOMALI VE NORMAL AKCİĞER DOKU FIBROBLAST KÜLTÜRLERİNDE BAZİK FİBROBLAST BÜYÜME FAKTÖRÜ (bFGF) 'NÜN KOLLAGEN VE MATRİKS METALLOPROTEİNAZ -2 (MMP-2) DÜZEYLERİ ÜZERİNE ETKİSİ Dr. Can Nakoman Ekstrasellüler matriks'in temel proteinlerinden olan kollagen metabolizmasında matriks metalloproteinazları (MMP'ler) ve metalloproteinazlann doku inhibitörleri (TIMP'ler) önemli yer tutar. Tümör invazyonunda, bu parametrelerin önemi giderek artmaktadır. Akciğer kanserleri ise, tüm kanserler arasmda mortalite açısmdan birinci, insidans açısmdan ikinci sırada yer almaktadır. Bu araştırmanın temel amacı, bazik fibroblast büyüme faktörünün (bFGF) normal ve karsinomah insan akciğer fibroblast hücre kültürlerinde kollagen düzeyi ve bunun yanı sıra kollagenaz (Matriks metalloproteinaz-2 MMP-2) ile bu enzimin aktivitesini kontrol eden doku metalloproteinaz inhibitör-2 (TIMP-2) düzeyleri üzerindeki etkilerinin kantitatif olarak incelenmesi ve kryaslanmasıdır. Bu çalışmada MMP-2 'nin seçiliş nedeni, invazyon ve metastazda önemli olan bazal membran degradsyonunda tip IV kollagen yıkdımı için spesifitesinin yüksek olmasıdır. Tip I kollagenin seçiliş nedeni ise akciğer dokusunun major kollagen komponenti olmasıdır. Bu araştırmada, 11 akciğer kanser olgusundan elde edilen karsinoma ve normal akciğer doku örnekleri üzerinde; ayrıca, 11 olgunun normal ve karsinomah dokularından elde edilen fibroblast kültürlerinde çalışılmıştır. Tüm dokular, Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Kalp ve Damar Cerrahi Anabilim Dalı'nda cerrahi girişim uygulanan hastalardan elde edilmiştir. Doku düzeyinde yapdan kollagen düzeyi belirlemeleri için Taugard'ın hidroksiprolin yöntemi kullanılmıştır. Hücre kültürlerinde MMP-2, TIMP-2 ve Tip I kollagen incelemeleri için enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ve total kollagen için ise kolorimetrik (Sircol) metod kullanılmıştır. Hücre kültürlerinde bFGF'in, MMP-2, TIMP-2, Total kollagen ve Tip I kollagen üzerindeki etkisini karşılaştırabilmek için 0-10-100 ng/ml konsantrasyonlarında 10çalışılmıştır. Her olgunun normal ve karsinoma dokuları fibroblast kültürlerinde her dört parametrenin düzeyleri karşılaştırılmalı biçimde incelenmiştir. İstatistiksel analiz, Mann Whitney U testi ile gerçekleştirilmiş ve parametreler arasındaki korelasyonların incelenmesi için Spearman korelasyon analizi yapılmıştır. Doku düzeyinde yapdan çalışmada, normal ve karsinoma akciğer dokuları arasında kollagen düzeyleri yönünden anlamlı farklar bulunmamıştır. Normal ve karsinoma hücre kültürleri arasmda MMP-2, TIMP-2, total kollagen ve Tip I kollagen düzeyleri arasında 103 hücre bazmda bulunan düzeyler arasmda istatistiksel olarak anlamlı farklar bulunmamıştır. Buna karşın, MMP-2 ve TIMP-2 düzeyleri arasmda normal (p = 0.016) ile karsinoma (p = 0.001) fibroblast kültürlerinde pozitif yönde anlamlı korelasyonlar gözlenmiştir. Total kollagen ve MMP-2 arasmda da karsinoma kültürlerinde pozitif yönde anlamlı korelasyonlar bulunmuştur (p = 0.002 ve p = 0.032). Total kollagen ve TIMP-2 arasmda da 100 ng/ml konsantrasyonda bFGF konulan karsinoma fibroblast kültürleri haricindeki tüm kültürlerde pozitif yönde güçlü korelasyonlar gösterilmiştir ( p = 0.001, p = 0.011, p = 0.000). Yine Tip I kollagen ve MMP-2 düzeyleri arasmda yalnızca normal ve karsinoma dokuları fibroblast kontrol kültürlerinde pozitif yönde anlamlı korelasyonlar bulunurken ( p = 0.016, p = 0.001), Tip I kollagen ve TIMP-2 arasmda 100 ng/ml konsantrasyonda bFGF konulan normal kültürler haricindeki tüm kültürlerde pozitif yönde güçlü korelasyonlar saptanmıştır (p = 0.000, p = 0.003, p = 0.002, p = 0.039, p= 0.001). Bu çalışmanın sonuçlarına göre, insan akciğerinden in vitro olarak elde edilmiş fibroblast kültürlerinde bFGF'ün, MMP-2, TEVIP-2, total kollagen ve Tip I kollagen düzeyleri üzerine, gerek normal, gerekse karsinomalı örneklerde, anlamlı bir etkisi görülmemiştir. Böyle olduğu halde bFGF'ün bu dört parametre arasmda normalde gerek karsinoma, gerekse normal akciğer dokusunda bulunan dengeyi bozduğu görülmektedir. BFGF'in, insan akciğer karsinoma dokusundan in vitro hücre kültürü yolu ile elde edilen fibroblastlann çeşitli biyolojik etkinlikleri (kollagen, MMP-2, TIMP-2 üretimi) üzerindeki olası etkileri ile ilgili olarak gerçekleştirilen bu çalışmada ortaya çıkartılan ve tıp literatüründe ilk kez sunulan bu verilerin, ileride yapdacak in vivo çalışmalarla birleştirilmesi ile, kanserin terapisi açısından yeni bakış açıları ortaya çıkarmasına katkıda bulunması beklenmektedir. Anahtar sözcükler : bFGF, ekstrasellüler matriks, akciğer karsinomu, total kollagen, tipi kolagen, MMP-2, TIMP-2. 11

SUMMARY EFFECT OF BASIC FIBROBLAST GROWTH FACTOR (bFGF) ON COLLAGEN AND MATRIX METALLOPROTEINASE (MMP-2) LEVELS IN NORMAL AND CARCINOMA LUNG CELL CULTURES Dr. Can Nakoman Matrix metalloproteinases (MMP's) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP's) possess a preponderant role in the metabolism of the major extracellular matrix protein, collagen. The elucidation of the mechanism of these parameters in tumor invasion has been an interesting challenge for researchers on extracelular matrix in the last decade. Lung cancer occupies the first position in mortality and the second position in incidance, among all cancers. The objective of this investigation is to study quantitatively and to compare the effect of basic fibroblast growth factor (bFGF) on collagen, matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue metalloproteinas inhibitor-2(TIMP-2) levels in normal and carcinoma lung tissue fibroblast cell cultures. MMP-2 was selected because of its high specificity in the degradation of type IV collagen, major component of the basal membrane. Type I collagen was selected for being one of the major collagen types in lung tissue. This investigation has been carried out on carcinoma and normal lung tissue samples of the same cases (n=ll) and on fibroblast cultures from the same tissues, obtained at surgical intervention at the Department of Cardiovascular Surgery, Dokuz Eylül University School of Medicine. The hydroxyproline method of Taugard was used for the estimation of total collagen contents at the tissue level. The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used for the determination of MMP-2, TIMP-2, and type I collagen levels, while a colorimetric (Sircol) assay was applied for total collagen levels assays in cell cultures. 12The effect of bFGF on MMP-2, TIMP-2, total collagen, and type I collagen levels was investigated at 0, 10, and 100 ng/ml concentrations. For each pathological type and its normal counterpart, the levels of the four parameters were comparatively studied. For statistical analysis of the data, Mann Whitney U test was employed, and possible correlations were searched using the Spearman correlation analysis method. No significant difference was found for total collagen levels between the normal and carcinoma tissues. For cell culture studies, MMP-2, TIMP-2, total collagen and type-1 collagen levels based on cell counts (103 cells) showed no statistically significant differences between the carcinoma and normal cell cultures. However, positive correlations were found between MMP-2 and TIMP-2 in normal (p=0.016) and carcinoma (p=0.001) tissue fibroblast cultures. Positive correlations were also found between total collagen and TIMP-2 levels in normal and carcinoma tissue fibroblast cultures (p = 0.002 and p = 0.032). In addition, total kollagen and TIMP-2 levels also showed positive and strong correlations (p = 0.001, p = 0.011, p = 0.000) in all cultures except in 100 ng/ml bFGF concentrations, In addition,, type I collagen and MMP-2 levels showed positive significant correlations ( p = 0.016, p = 0.001), only in normal and carcinoma control cultures (0 ng/ml bFGF), while type I collagen and TEVIP-2 levels showed positive correlations in all cultures except carcinoma fibroblasts at 100ng/ml bFGF (p = 0.000, p = 0.003, p = 0.002, p = 0.039, p= 0.001). These data allow for the following conclusions: bFGF showed no statistically significant differences for MMP-2, TIMP-2, total collagen and type-1 collagen levels in fibroblast cultures grown from human carcinoma and normal lung tissues. However, bFGF was noted, in vitro, to disturb the equilibrium which normally exists between the four parameters, both in normal and carcinoma tissue fibroblasts. These results of this study on the effect of bFGF on the biological activities of fibroblasts (collagen, MMP-2, TIMP-2 production) grown in culture from human normal and carcinoma lung tissues, obtained for the first time and presented to medical literature, are expected to contribute, along with other future studies performed in vivo, to novel perspectives in cancer therapy. Key words: bFGF, extracellular matrix, lung carcinoma, total collagen, type I collagen, MMP-2, and TEVIP-2. 13