Hepatosit büyüme faktörü ile stimule edilen motilite, ivazyon ve anjiogeneze yol açan sinyal iletimi molekülleri ve genlerin faj sunum yöntemi ile araştırılması

Abstract

ÖZET HGF ile Stimule Edilen Motilite, İnvazyon ve Anjiogeneze Yol açan Sinyal İletimi Molekülleri ve Genlerinin Faj Display Yöntemi ile Araştırılması Gülay Bulut Dokuz Eylül Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyloji ve Genetik ABD, İnciraltı, İZMÎR Hepatosit Büyüme Faktörü (HGF), embriyogenez, doku rejenerasyonu, karsinogenez ve anjiogenez gibi karmaşık birçok biyolojik olayda önemli rolü olan pleotrofık etkili bir büyüme faktörüdür. Bu etkilerini, transmembranal reseptör tirozin kinaz olan reseptörü c-Met aracılığı ile gerçekleştirmektedir. Hipoksi gibi çevresel uyaranların ya da adaptör proteinlerin bağlanmasını engelleyen inhibitor moleküllerin varlığında HGF/c-Met yolağının etkilendiği, özellikle hipoksik koşullarda c-Met ekspresyonu ve multisubstrat bağlama bölgesinin fosforu asyonunda artış olduğu, bunun yanı sıra HGF stimüle hücre motilitesi, invazyon ve dallanma morfogenezinin değişiklik gösterdiği bilinmektedir. Buna bağlı olarak, multisubstrat bağlanma bölgesine bağlanan moleküllerin tanımlanması ve bu moleküllerin işlevlerinin belirlenmesi giderek önem kazanmaktadır. Bu çalışmada hipoksi ve Grb2 SH2 domain inhibitörü varlığında c-Met multisubstrat bağlama domaini üzerinden gerçekleşen proten-protein etkileşimlerinin T7 cDNA faj sunum yöntemi ile tanımlanması amaçlandı. c-Met'in bu bölgesini temsil eden P1356, FIGEH{pTYR}VHVNA ve P1349, HVNAT{pTYR}VNVKC sentetik peptid dizilerinin hedef olarak kullanıldığı deney sisteminde, HGF ile uyarılmış hiposik koşullarda ve Grb2 SH2 domain inhibitörleri varlığında hazırlanan cDNA kütüphaneleri içinden bu dizilere bağlanan klonlar seçildi. Bu klonların homoloji analizi sonucunda SH2 ve PTB bölgeleri aracılığı ile hedef dizilerimize bağlandığı düşünülen 12'si farklı olmak üzere toplam 16 aday protein (P1356'ya bağlanan, inhibitor kütüphanesi üyeleri STAT6, EPS8, SHC1, LDLRAP ve RALP, hipoksikütüphanesi üyeleri RASAİ, FYN ve S0CS4; P1349'a bağlanan, inhibitor kütüphanesi üyeleri SHB, SUPT6H ve IRS4, hipoksi kütüphanesi üyesi TBC1D4) tanımlandı. Elde edilen aday proteinlerin aktive c-Met'e hipoksi ya da Grb2 SH2 domain inhibitörü varlığında bağlanan proteinler olabilecekleri ve HGF/c-Met stimüle tümörigenez ile ilişkili olan biyolojik yanıtlarda önemli rol oynayabileceği düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: HGF, c-Met, hipoksi, Grb2 SH2 inhibitor, faj sunumu, cDNA kütüphanesi

ABSTRACT Identification of Signaling Molecules and Genes Leading to HGF Stimulated Motility, Invasion and Angiogenesis by Phage Display Gülay Bulut Dokuz Eylul University, Faculty of Medicine, Medical Biology and Genetics Department, Inciralti, IZMIR Hepatocyte growth factor (HGF) is a pleiotropic factor that plays an important role in complex biological processes such as embryogenesis, tissue regeneration, carcinogenesis and angiogenesis. It promotes these responses through binding to its receptor, a transmembrane receptor tyrosine kinase c-Met. It is reported that environmenral conditions like hypoxia or treatment with inhibitor molecules that block binding of adaptor proteins effect HGF/c-Met signalling. Especially under hypoxia, changes in HGF stimulated motility, invasion and branching morphogenesis have been announced. Due to this data, identification of molecules binding to multidocking site (MDS) on c-Met is of great importance. In this study, we aimed to show the changes in protein-protein interactions within c- Met MDS under hypoxia and with Grb2 SH2 domain inhibitor treatment by using cDNA T7 phage display. Two synthetic peptide sequences P1356, FIGEH{pTYR}VHVNA and P1349, HVNAT{pTYR}VNVKC resembling the MDS of c-Met were used as baits for affinity selection of the ligand spesific clones within cDNA libraries. According to homology search of these clones, 12 different and a total of 16 candidate proteins containing SH2 and/or PTB domains were identified. Those with binding affinity for P1356 within the inhibitor library were STAT6, EPS8, SHC1, LDLRAP, RALP and within the hypoxia library were RASA1, FYN and SOCS4. The candidates with binding affinity for PI 349 within the inhibitor library were SHB, SUPT6H, IRS4 and within the hypoxia library wasTBClD4.We conclude that these candidate proteins may interact with activated c-Met under hypoxia or as a result of Grb2 inhibitor treatment and they may be crucial in biological responses related with HGF/c-Met stimulated tumorigenesis. Keywords: HGF, c-Met, hypoxia, Grb2 SH2 inhibitor, phage display, cDNA library