Hepatit delta virüsünün delta antijen geninin klonlanması.

Abstract

1. ÖZETnfeksiyon oluşturabilmesi için Hepatit B virus (HBV) yüzey antijenine gereksinimduyan hepatit delta virus (HDV), yaklaşık 1700 nükleotit uzunluğunda ve antijen olarakyalnızca hepatit delta antijeni (HDAg) kodlayan bir genoma sahiptir. Bu çalışmada HDAg yikodlayan bölgenin klonlanarak çoğaltılması amaçlanmıştır.Gen bankasından indirilen ve Türkiye'de bildirilen tek genotip olan genotip I dizilerireferans alınarak hazırlanan öncül setleri kullanılarak çoğaltılan HDAg bölgesi polimerazzincir tepkimesi (PZT) ile çoğaltılarak saflaştırıldı. Saflaştırılan ürünün içerdiği DNA miktarıhesaplanarak vektör-insert oranı ayarlandıktan sonra pGEM® T-easy vektörüne (Promega)takıldı. Elde edilen rekombinant DNA Escherichia coli JM109 hücrelerine transforme edilerekçoğaltıldı. Ampisilin ve mavi beyaz tarama sonucunda elde edilen hedef koloniler çoğaltılarakplazmit saflaştırılması gerçekleştirildi.Doğru dizinin vektöre takılıp takılmadığının anlaşılması için öncüller kullanılarak hedefbölge yeniden PZT ile çoğaltıldı, EcoR I ve Not I kullanılarak yapılan restriksiyon enzimanalizi ile plazmit kesildi ve DNA dizi analizi yapılarak dizinin doğruluğu kontrol edildi.Klonlama ürünü olarak saflaştırılan plazmitlerden yapılan PZT ile beklenen büyüklükteki786 bp lik ürün elde edildi. Ayrıca plazmitlerin EcoR I ile kesimi sonucunda 248, 553 ve 2995bp lik doğru bantlar elde edildi. Yine aynı plazmitlerin Not I ile kesimi sonucunda 819 ve 2982bp lik doğru bantlar elde edildi. DNA dizi analizi ile de HDAg bölgesinin varlığı doğrulandı.Elde edilen klonlama ürünlerinin, ileride yapılacak olan kantitatif PZT çalışmalarında miktarıbelli pozitif kontrol ve DNA dizi analizi ile oryantasyonun doğrulanmasından sonra HDAgprotein ekspresyonu çalışmalarında kalıp olarak kullanılması düşünülmektedir.Anahtar Kelimeler : HDV, PZT, Klonlama, REA11

2. SUMMARYHepatitis delta virus (HDV) is a satellite of hepatitis B virus (HBV) and possesses aclosed circular single-stranded RNA genome of approximately 1700 bases. The genome has anopen reading frame (ORF) in the antigenomic polarity that encodes the hepatitis delta antigen(HDAg) of 195 amino acids. In this study, cloning of the whole delta antigen gene was aimed.Primers for PCR amplification were selected from conserved HDV genotype I sequencesof the delta antigen gene, since this is the only HDV genotype reported in Turkish patients.HDAg region of the HDV gene was amplified by PCR using the choosen primer set.Amplicons were purified and DNA contents were quantified. After the adjusment ofvector-insert ratio, the purified amplicon were ligated into the pGEM® T-easy vector(Promega). The recombinant DNA was transformed to the Escherichia coli JM109 cells.Target colonies were determined by using ampicillin and blue white colony screening andcultured in LB broth. Plasmids were purified.Target region was amplified by PCR using the same primers in order to prove thesequence was inserted to the vector. Furthermore, the plasmid containing the insert wasevaluated by restriction enzymes EcoR I, Not I and DNA sequencing.A 786 bp amplicon was generated by the PCR of the plasmid as expected. The restrictiondigest of the plasmid with EcoR I produced 248, 553 and 2995 bp bands, while the digestionwith Not I gave 819 and 2982 bp bands. These results and the DNA sequencing analysisconfirmed the succesful cloning of the HDAg gene in the correct orientation. The cloned HDVgene segment is planned to be used as a positive run control or quantification standart for thefuture HDV RT-PCR studies. It can also be used for generating HDAg protein after subcloningto an expression vector.Keywords : HDV, PCR, Cloning, REA12