Klebsiella pneumoniae ve escherichia coli suşlarında genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz genlerinin klonlanması

Abstract

Amaç: Bu çalışmada, kan kültürlerinde üretilmiş, fenotipik testler ve PZR ile farklıgenişlemiş spektrumlu beta laktamazlar ürettiği belirlenmiş klinik Klebsiella pneumoniae veEscherichia coli izolatlarındaki blaCTX-M, blaSHV, blaTEM genlerinin klonlanması amaçlanmıştır.Yöntem: Çalışmaya, Dokuz Eylül Üniversitesi Hastanesinde 2004 yılında kan kültürlerindenizole edilen toplam 21 E. coli ve K. pneumoniae suşu alındı. Suşlarda blaCTX-M, blaSHV, blaTEMvarlığı PZR ile araştırıldı. Aralarından farklı GSBL'ler üreten altı izolat seçildi ve bu izolatlarklonlama çalışmalarına alındı. Klonlama için T/A klonlama yapan ''InsTAclone? PCRCloning Kit'' kullanıldı. Doğru genlerin klonlandığının anlaşılması amacıyla koloni PZRyapıldı. Klonlanan genin varlığını göstermek için dizi analizi öncesi klonlardan plazmidizolasyonu yapıldı. Seçilen suşlardan blaCTX-M, blaSHV, blaTEM genlerinin nükleotid dizilerininbelirlenmesi için dizi analizi yaptırıldı.Bulgular ve Sonuç: Çalışmaya alınan toplam 21 suşta GSBL pozitifliği saptandı. PZRsonucu CTX-M-1 pozitif olan suşların sayısı 18, TEM pozitif olan suşların sayısı 11, SHVpozitif olan suşların sayısı 9 olarak saptandı. Seçilen izolatlardaki bla genlerinin klonlanmasısonucunda, PZR ürününü alan vektörlerde lacZ geni inaktive edildiği için LB agarda laktoznegatif, beyaz koloniler; PZR ürününü almayan vektörlerde ise laktoz pozitif mavi kolonileroluştu. Koloni PZR ile klonların aktarılan gen açısından pozitif olduğu bulundu. Dizi analizisonuçlarına göre CTX-M klonlarında CTX-M-3 ve CTX-M-15, SHV klonlarında SHV-5 veSHV-12 ve TEM klonlarında ise TEM-1 bulundu. Sonuçlarımıza göre GSBL üreten TEMklonlarının seçiminde başarısız olunduğu düşünüldü.

Objective: To perform cloning of blaCTX-M, blaSHV and blaTEM genes which are found inextended spectrum beta-lactamases Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli strainsisolated from blood cultures.Methods: Twenty one K. pneumoniae and E. coli strains isolated from blood cultures atDokuz Eylul University Hospital in 2004 were taken in to the study. blaCTX-M, blaSHV, blaTEMpresence was sought by PCR. Six isolates producing different ESBL types were selectedamong these isolates and these strains were taken in to the cloning studies. InsTAclone?PCR Cloning Kit was used for T/A cloning. Colony PCR was performed to ascertain that thecorrect genes was cloned. Plasmid extraction was performed to reveal the presence of clonedgenes before sequencing. Sequencing was performed on both strands to determine nucleotidesequences of blaCTX-M, blaSHV, blaTEM genes from selected strains.Results and Conclusion: ESBL pattern was detected in 21 strains in our study. According tothe result of specific PCR for bla genes, eighteen isolates had blaCTX-M, nine isolates hadblaSHV and eleven of them had blaTEM.. As a result of cloning, vectors with PCR product whichhad inactive lacZ gene produced lactose negative, lucid colonies on LB agar. On the otherhand vectors without PCR product produced lactose positive, blue colonies on LB agar.Clones were found positive for the transfered genes. The sequence analysis revealed that;CTX-M-3 and CTX-M-15 were found in the CTX-M clones, SHV-5 and SHV-12 were foundin the SHV clones and TEM-1 were found in the TEM clones. According to the results, therewas a failure in selecting of TEM clones producing GSBL.