Pseudomonas aeruginosa`da; aminoglikozidlerin (Gentamisin, netilmisin, amikasin) etkisinde quorum sensing-sitokin ilişkisi: Konak cevabının kinetiği

Abstract

Bakterilerin, ökaryotik bir özellik olan, `birbiri ile iletişim halinde yaşama` özelliğini sergileyebildiği gösterilmiştir. Patojenik bakteriler; topluluk halinde yaşadıklarında, virülans faktörlerini çok daha etkili kullanabilmektedir. Topluluk düzeyindeki virülans özellikler olarak bilinen biyofilm oluşumu ve hücreden hücreye iletişim sistemini (quorum sensing: çoğunluğu algılama) açıklamak için Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) önemli bir bakteriyel modeldir. Başarılı bir bakteriyel eradikasyonun birçok biyoaktif bileşenin sinerjisine bağlı olduğu görülmektedir. Antibakteriyel yoğunluğunun azaldığı zaman dilimlerinde (subminimal inhibitör konsantrasyon), P. aeruginosa' nın konak hücre ile girdiği etkileşim bakteriyel eradikasyonu etkiler görünmektedir. Bu noktada; bu zaman dilimlerindeki P. aeruginosa konak etkileşiminin in vitro ve canlı hücre dizisinde enfeksiyon modeli kinetiği; enfeksiyonun gelişim süreci ve antibiyotiklerin konsantrasyonlarının, tedavi ölçütlerini belirlemedeki etkisi üzerine önemli fikirler verecektir. Bu amaçla; önce in vitro olarak aminoglikozidler (gentamisin, netilmisin, amikasin) etkisinde standart ATCC 27853 P. aeruginosa ve klinikten izole edilen iki klinik P. aeruginosa suşlarının gentamisin, netilmisin, amikasin antibiyotiklerinin minimum inhibisyon konsantrasyonları (MİK) belirlenmiştir. Daha sonra belirlenen bu konsantrasyonların etkisinde zamana bağlı olarak çoğunluğu algılama yanıtları, bağlanma-aljinat üretimi, biyofilm oluşumları, alkalen proteaz ve jelatinaz enzimlerinin üretimleri hem in vitro koşullarda hem de hücre kültür dizisi (enfeksiyon modeli) koşullarında araştırılmıştır. Enfeksiyon modeli, HEp- 2 hücre dizileri standart ATCC 27853 P. aeruginosa ve klinikten izole edilen iki klinik P. aeruginosa suşu ile enfekte edilerek oluşturulmuştur. Daha sonra enfekte hücrelere aminoglikozidlerin belirlenen MİK ve sub- MİK yoğunlukları eklenerek; zaman bağlı apoptoz/ nekroz, sitokin ve nitrik oksit yanıtları ve hücreler steril distile su ile patlatıldıktan sonra alınan bakterilerde zamana bağlı olarak bağlanma-aljinat üretimi, biyofilm oluşumu, alkalen proteaz, jelatinaz enzimlerinin üretimi ve çoğunluğu algılama sistemleri yanıtları arasındaki olası ilişki zamana bağlı olarak sorgulanmıştır. In vitro koşullarda ve hücre kültür dizilerinde zamana bağlı olarak, aminoglikozidlerin etkisindeki suşların bağlanma-aljinat üretimi, biyofilm oluşumu, apoptoz-nekroz yanıtları, nitrik oksit yanıtları ANOVA yöntemiyle analiz edilmiştir. Son değerlendirmeler elde edilen bu sonuçların, antibiyotik uygulanmayan bakteri yanıtları (kontrol) ile `Tukey' s comparison test` ile karşılaştırılarak yapılmış ve istatistiksel anlamlılıkları belirlenmiştir. Bütün suşlarda aminoglikozidler etkisinde; 1. Sıfır, dokuz ve 12. saatlerde her iki çoğunluğu algılama sisteminin çalışmadığı, ancak 2. Altıncı ve 18. saatlerde her iki çoğunluğu algılama sisteminin de çalıştığı saptandı. 3. Bağlanma- aljinat üretiminin; in vitro' da 12. saatte başladığı ve 18. saatte devam ettiği belirlendi. 4. Enfeksiyon modelinde ise standart ATCC 27853 P. aerginosa; suşunun 9, 12 ve 18. saatlerde bağlanma- alijnat üretiminin olduğu görüldü. 5. K1 ve K2 suşlarının 9. saatte bağlanma- aljnat üretimlerinin olduğu 12. saatte biyofilm oluşturdukları görüldü. 6. Onsekizinci saatte ise aminoglikozidlerin tüm suşların bağlanma-aljinat üretimi ve biyofilm oluşumunu baskıladığı belirlendi. 7. Sıfırıncı saatten itibaren enfekte hücrelerde artarak görülen nitrik oksit yanıtının, 18. saatte azaldığı görüldü. 8. Aminoglikozidlerin etkisinde enfekte hücrelerin nitrik oksit yanıtlarının kontrole göre azaldığı görüldü (p˂005). 9. Suşa ve zamana bağlı olarak artan apoptoz/ nekroz hücrelerinin 18. saatte bütünlüğünü kaybettiği görüldü. 10. Enfekte hücrelerde 18. saatte sitokin yanıtının olmadığı görüldü. Sonuç olarak; antipseudomonal aminoglikozidlerin etkisi altında bile, P. aeruginosa' nın konak bağışık sistemine etkide bulunabildiğini ve bağlanma-aljinat üretiminin, biyofilm oluşumunun da bu etkileşimde rolünün olabileceğini anlaşılmıştır. Hastadan izole edilen bakterinin önce bağlanma- alijinat üretimi/ biyofilm oluşturma özelliğinin belirlenmesi ve daha sonra bu özellik dikkate alınarak, `biyofilm temelli duyarlılık testi` klinik açıdan yararlı olacaktır.

It was shown that bacteriae may show similar characteristics like `living in a coordinative manner` as in eukaryotes. Pathogenic bacteriae may use their virulence characteristics in more effective way when living in a community. Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is an important bacterial model in order to explain the biofilm formation and cell to cell communication systems (quorum sensing; QS) which are the community level virulence characteristics. A successful bacterial eradication depends on the synergy of many bioactive components. P. aeruginosa - host relation during the periods of the decreased antibacterial concentrations (subminimal inhibitory concentration) seems to affect the bacterial eradication. At this point; in vitro and in living cell kinetics of the P. aeruginosa host relation may give important ideas in determining the therapy measures by the process of infection progress and antibiotic concentrations.For this purpose, first of all, minimum inhibitory concentrations of aminoglycosides (gentamicin, amikacin, and netilmicin), standard ATCC 27853 P. aeruginosa strain and two clinical strains were determined. Time depended QS response, production of gelatinase, alkalene protease enzymes, binding- aliginat production, biofilm production, were studied under these concentrations kinetically at in vitro and in cell culture conditions. Infection model was established by two clinically isolated strains and standart ATCC 27853 P. aeruginosa strain's cell line of HEp- 2 cells. Then determined MIC and sub- MIC concentrations of aminoglycosidases were added to infected cells. The possible relation between time dependent apoptosis/ necrosis, cytokine and nitric oxide responses, and time dependent QS responses and alkalen protease, gelatinase enzymes production, binding- alginate production, biofilm formation of bacteria which were harvested from blasted cell lines by distiled steril water were questioned. Under the effect of aminoglycosides; time depent binding- alginate production, biofilm formation, apoptosis-necrosis and nitric oxide responses of strains in vitro and in cell culture conditions were analyzed by ANOVA. Final evaluations were done by comparison of nontreated bacterial responses by Tukey's comparison test, and statistically significant values were determined.In all strains under the effect of aminoglycosides; 1. At the 0, 9 and 12th hours both two QS systems did not work, but 2. At the 6 and 18th hours did work. 3. Binding- alginate production started at 12th hours and continued at 18th hours in vitro.4. At 9, 12 ve 18th hours binding- alginate production of standard ATCC 27853 P. aeruginosa were observed. 5. At 9th hour binding- alginate production of K1 and K2 strains was determined, biofilm formation was observed at 12th hour. 6. At 18th hour it was found that aminoglycosides were inhibited binding- alginate production and biofilm formation in all strains of bacteria. 7. Since the 0. hour nitric oxide responses were increased but decreased at 18th hour at infected cells 8. Nitric responses of infected cells were decreased under the aminoglycosides effect compared to control (p˂005). 9. It was found that integrity of apoptotic- necrotic cells were lost at 18th hour depend on strains and time. 10. It was found that there was no cytokine response of infected cells at 18th hour. As a result it was found that P. aeruginosa may affect the immune system of the host, and binding- alginate production, biofilm formation may take part in this relation even if there is an aminoglycoside effect. Determination of the biofilm production characterization of isolated bacteria from the patient and when binding-alginate production/ biofilm formation was found positive then `biofilm based susceptibility testing` application may be useful clinically.