Β-amiloid peptid varlığında nöronal kalsiyum/kalmodulin-bağımlı Protein Kinaz 2 (CaMK-II) değişimlerinin nörodejenerasyon sürecine etkisi

Abstract

Demansın en yaygın şekli olarak karşımıza çıkan Alzheimer hastalığı (AH) bilişsel fonksiyon azalmasının görüldüğü ilerleyici bir nörodejenerasyon durumudur. Hafızanın oluşturulmasında CaMK-II kilit bir enzim olup hem geçmiş hem de şimdiki hücresel aktiviteyi temsil eden `sürekli` bir kalsiyum sinyallemesinin dinamik doğasına özgü, geçici bilgileri entegre ettiği ileri sürülmektedir. Ancak, dört izoformu olan CaMK-II enzim sinyalinin yokluğunda veya değişiminde hücresel aktivite/fizyolojinin nasıl etkilendiği henüz net olarak tanımlanamamıştır. Bu tez projesinde, in vitro Alzheimer modeli oluşturularak, ekstraselüler Aβ1-42 varlığının, nöronal CaMK-II izoform değişimleri ve hücre canlılığı üzerine etkisinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır.SH-SY5Y hücrelerine, önceden agrege edilmiş Aβ1-42 peptidi 72 saat süresince uygulandı. CaMK-II enzim inhibitörü KN93 varlığı ve yokluğunda MTT ve LDH testi ile hücre canlılığı ve hücre kültür ortamındaki kalsiyum düzeyi fotometrik olarak değerlendirildi. CaMK-II enzimi alfa, beta, gama ve delta izoformlarının m-RNA ekspresyon değişimleri RT-PCR yöntemi kullanılarak belirlendi. Hücresel beta ve alfa izoformlarının değişimi ELISA yöntemi ve immünfloresan mikroskopi ile değerlendirildi. 10 µM Aβ1-42 uygulaması hücre canlılığını %50 oranında azaltırken LDH salınımını benzer oranda arttırdı (p<0,05). KN93 uygulaması ise Aβ1-42 toksisitesine karşı koruyucu etki göstermedi. Aβ1-42 uygulamasının, CaMK-II enzimi mRNA ekspresyonlarını kontrol grubuna göre belirgin azalttığı (p<0,05), alfa izoformunun hücresel birikimine neden olduğu belirlendi.Bu tez çalışması ile literatür taramamıza göre ilk kez, Alzheimer hastalığının temel patolojik bulgularından olan amiloid plakları oluşturan Aβ peptidlerin toksik konsantrasyonlarda CaMK-II enziminin izoformlarının ifadesini ve düzeyini değiştirebildiği gösterildi. Nöronal CaMK-II enzim izoform değişimlerinin hücre sağ kalımında kritik bir basamak olduğu ve hücrenin kendisini koruması için tetiklendiği düşünülebilir.

Alzheimer's disease (AH), which is the most common form of dementia, is a progressive neurodegeneration condition in which cognitive dysfunction is observed. CaMK-II is a key enzyme in the creation of memory, and it is claimed to integrate temporary information specific to the dynamic nature of a `continuous` calcium signaling representing both past and present cellular activity. However, how the cellular activity / physiology was affected in the absence or exchange of the CaMK-II enzyme signal with its four isoforms has not yet been clearly defined. In this thesis, it was aimed to evaluate the effect of extracellular Aβ1-42 presence on neuronal CaMK-II isoform changes and cell viability by creating an in vitro Alzheimer model. The pre-aggregated Aβ1-42 peptide was applied to SH-SY5Y cells for 72 hours. In the presence and absence of CaMK-II enzyme inhibitor KN93, cell viability and calcium level in the cell culture medium were evaluated photometrically by MTT and LDH test. The m-RNA expression changes of CaMK-II enzyme alpha, beta, gamma and delta isoforms were determined using RT-PCR method. The changes of cellular beta and alpha isoforms were evaluated by ELISA method and immunofluorescence microscopy. Application of 10 µM Aβ1-42 decreased cell viability by 50% while increasing LDH release similarly (p <0.05). KN93 application did not have a protective effect against Aβ1-42 toxicity. Application of Aβ1-42 was found to significantly reduce CaMK-II enzyme mRNA expressions compared to the control group (p <0.05), causing alpha cellular accumulation of alpha isoform.According to our literature review, for the first time, it was shown that Aβ peptides can change the expression and level of isoforms of the enzyme CaMK-II at toxic concentrations. It can be thought that neuronal CaMK-II enzyme isoform changes are a critical step in cell survival and triggered to protect the cell itself.