Tavuk kalbinden süperoksit dismutazın saflaştırılması, karakterizasyonu ve immobilizasyonu

Abstract

VI ÖZET Tüm aerobik organizmalarda ve bazı aeroblarda, bir metaloenzim olarak bulunan ve süperoksit serbest radikallerinin (02`) giderilmesini sağlayan süperoksit dismutaz (SOD, 1.15.1.1), tavuk kalbinden saflaştırıldı, karakterize ve immobilize edildi. SOD'un saflaştırılması, amonyum sülfat ile fraksiyonlama ve hemoglobin'in uzaklaştırılmasının ardından, CM-Selüloz iyon değişim kromatografisi ve Sephadex G- 75 jel kromatografisi ile gerçekleştirildi. Sephadex G-75 jel filtrasyon sonrası enzim, 31000±1000 moleküler ağırlığa sahiptir ve elektroforez ve atomik absorpsiyon spektroskopi sonuçlarına göre Cu ve Zn elementleri içeren eşit büyüklükte iki alt birimden meydana gelmektedir. CuZnSOD enzimi, hem siyanüre hem de hidrojen peroksite hassastır. GDA ile enzimin immobilizasyonu, değişen pH ve +4°C sabit temperaturde enzim ve taşıyıcı oranlarının değişen miktarları için 0.5 mg/ml BSA varlığında ve yokluğunda gerçekleştirildi. %3 GDA/BSA+0.5 mg/ml SOD (SOD-I) ve %3 GDA/0.5 mg/ml SOD (SOD-H) için en iyi aktivite değerleri sırasıyla %27.5 ve %19 olarak bulunmuştur. Doğal ve immobilize SOD-I ve -II için optimum pH değerleri sırasıyla 8.8, 8.3 ve 8.25 dir. Hem doğal hem de immobilize enzim türevlerinin 25°C de 6 saatlik inkübasyon sonrası, pH 6.5-8.5 aralığında stabil kaldığı saptanmıştır. 65°C de doğal ve immobilize SOD-I ve -II için elde edilen aktivite değerleri, sırasıyla %80, %33, %52 dir. Ayrıca, doğal SOD enzimi üzerine iyonik şiddetin inhibitor etkisi incelendi ve sonuç olarak, artan iyonik şiddet ile monovalent iyonlar divalent iyonlara göre daha az inhibitor etki göstermiştir.

vn ABSTRACT Superoxide dismutase (SOD, 1.15.1.1) which is a metalloenzyme ubiquitously found in all aerobic organisms and in some aerobes and catalyses the removal of superoxide free radicals (O?) was purified, characterized and immobilized from chicken heart. Purifying of SOD was achieved by ammonium sulfate fractionation and removed Hb, followed by ion exchange chromatography on CM-cellulose and Sephadex G-75 gel chromatography. After gel filtration on Sephadex G-75, the enzyme has a molecular weight 31000+1000 and was composed of two equally sized subunits each having Cu and Zn elements according to electrophoresis and atomic absorption spectroscopy results. The CuZnSOD enzyme was sensitive to either cyanide or hydrogen peroxide. Immobilization of the enzyme with GDA was carried out with varying amounts of enzyme and support ratios both in the presence and absence of 0.5 mg/ml BSA at different pH at a constant temperature of 4°C. The best activity values were obtained for 3% GDA/BSA+0.5 mg/ml SOD, designated I and 3% GDA/0.5 mg/ml SOD, designated II as 27.5% and 19% respectively. Optimum pH values for native enzyme and immobilized SOD -I and -II were 8.8, 8.3 and 8.25 respectively. It was obtained that both native and immobilized enzyme derivatives remained stable at pH 6.5-8.5, at 25°C after 6 h incubation. The retained activity values for native and immobilized SOD-I and -II were 80%, 33%, 52% respectively at 65°C. Also, inhibitor effect of ionic strength on native SOD enzyme was investigated and as a result, monovalent ions were shown less inhibitor effect than divalent ions with increasing ionic strength.