Sınır hastalığı virüsü ile doğal enfekte kuzu ve oğlak beyinlerinde apoptotik ve anti-apoptotik mekanizmaların karşılıklı değerlendirilmesi

Abstract

Sınır Hastalığı (SH) Türkiye dahil, dünyada koyun ve keçi popülasyonlarında abortus veya persiste enfeksiyonlar nedeniyle ülke ekonomisinde ciddi kayıplara neden olan ve Pestivirüsler tarafından oluşturulan viral bir hastalıktır. Hücre kültüründeki sitopatojenitelerine göre Pestivirüsler, apoptotik hücre ölümünü tetikleyen sitopatik (SP) ve sitopatik olmayan (SPO) tür olarak ikiye ayrılırlar. Sitopatik olmayan türler enfekte ettiği hücrelerde apoptozisi engelleyici etki göstererek persiste enfeksiyondan sorumludur. Sınır Hastalığı Virüsü'nün (SHV) apoptotik ve anti-apoptotik mekanizmalarının merkezi sinir sisteminde araştırıldığı sınırlı sayıda çalışma vardır. Bu çalışmada, SHV enfekte kuzu ve oğlaklarda; apoptotik ve anti-apoptotik mekanizmaların karşılıklı araştırılması ve eğer varsa SHV'nin merkezi sinir sisteminde hangi yolakla apoptozisi tetiklediğinin ortaya konulması amaçlanmıştır. Bu amaçla da; SHV ile enfekte hayvanların beyin kökü ve orta beyin bölgesinde meydana gelen lezyonlarda; apoptotik (kaspaz 3, kaspaz 9) ve anti-apoptotik (Bcl-2) mekanizmalar, sitokin yanıtı (TNFR1, TNF-?, INF-?, eNOS ve iNOS), apoptotik hücre sayılarının tespiti (TUNEL), reaktif gliozis (GFAP), myelin hasarı (LFB) incelenerek sağlıklı kontrol dokuları ile karşılaştırılmıştır. Çalışmanın materyalini, moleküler ve immunoperoksidaz testlerle SH tanısı konulan 10 kuzu, 5 oğlak ve sağlıklı kontrol için ise sağlıklı 3 kuzu ve 3 oğlaktan alınan beyin dokuları oluşturmuştur. Parafine gömülen dokulardan alınan 5 ?m kalınlığındaki kesitler, hematoksilen-eozin ile boyandıktan sonra histopatolojik incelemede, nöron dejenerasyon ve nekrozu, gliozis, myelin kaybı, perivasküler hücre infiltrasyonu ve vaskülit bulguları dikkate alınarak lezyon şiddetine göre skorlandı. Bu çalışmada, SHV pozitif hayvanlardaki beyin kökü ve orta beyin bölgelerinden alınan kesitlerde; indirekt immunoperoksidaz testlerde tavşan-anti SHV poliklonal antikoru ve ticari firmalardan temin edilen apoptotik ve anti-apoptotik mekanizmaların tanımlanmasında rabbit poliklonal kaspaz 3, 9, Bcl-2, TNFR1, TNF-? ve INF- ?, TUNEL, GFAP, eNOS, iNOS antikorları ve myelin hasarı tespiti için histokimyasal boyama olarak da LFB kullanıldı. İmmunoperoksidaz test sonuçlarına göre; kaspaz 9, Bcl-2, TUNEL, GFAP, eNOS ve iNOS immunopozitif boyanma yüzde alanları, kontrol grubu hayvanlardakine oranla istatistiksel olarak önemli (p<0.05) düzeyde yüksek bulundu. Sağlıklı Kontrol grubu ve SHV pozitif hayvanlara ait TNFR1, TNF-? ve INF-? oranları arasında herhangi bir istatistiksel öneme rastlanmadı (p>0.05). Deney grubu hayvanlarda, enfeksiyonun şiddetinde artışla birlikte myelin kaybı ve reaktif glia hücrelerinde GFAP varlığının arttığı görülmüştür. Sınır Hastalığı Virüsü ile enfekte çalışma grubu hayvanlar ile sağlıklı kontrol grubu hayvanların karşılaştırılması sonucunda; en çarpıcı bulgu beyinde eNOS ve iNOS varlığının hastalığın şiddeti ile doğru orantılı artmasıdır ve bunun SHV enfeksiyonunda şekillenen apoptozis belirteçleri ile uyumlu olduğu gösterilmiştir. Aynı zamanda, SHV ile enfekte hücreler arasında apoptozise giden hücrelerin baskın olarak içsel yolu seçtikleri ve içsel yol üzerine de en büyük etkinin önemli derecede artan NO seviyesi ile ilişkili olabileceği ortaya konulmuştur. Deney grubu hayvanlarda görülen myelin kaybı ile GFAP varlığı sonuçlarına göre; enfeksiyonun şiddeti arttıkça dejenerasyon derecesinin de paralel olarak arttığı görülmüştür.

Border Disease is viral disease caused by Pestiviruses and has commonly been reported worldwide including Turkey. The disease creates a serious economic problem due to abortion and persistent infections in sheep and goats. Based on pathogenicity to cell culture, Pestiviruses are categorized into two classes: cytopathic (CP) and non-cytopathic, which have generally apoptotic and anti-apoptotic effects, respectively. Non-cytopathic viruses are responsible for persistent infections as they exert an anti-apoptotic effect in Pestivirus infected cells. There is limited number of studies focusing on the apoptotic and anti-apoptotic mechanisms in the central nervous system targeted by Border Disease Virus (BDV). In this study, investigation of comparision of apoptotic and anti-apoptotic mechanism and which pathway to trigger the apoptosis in cental nervous system in BDV infected lamb and kid was aimed. In BDV infected lesioned brain stem and mid brain regions, apoptotic (caspase 3 and caspase 9) and anti-apoptotic (Bcl-2) mechanisms, cytokine response (TNFR1, TNF-?, INF-?, eNOS, and iNOS), number of apoptotic cells (TUNEL), reactive gliosis (GFAP), myelin loss (Luxol Fast Blue-LFB) were examined and compared to control healthy tissues. The study materials included in the study were brain tissues collected form BDV diagnosed 10 sheep and 5 goats as well as control brain tissues from 3 lambs and 3 goat kids. Following sectioning from the paraffin embedded tissue, the 5 µm thick sections were stained with hematoxylin-eosin and examined histopathologically and scored according to presence and severity of neuron regenerations and necrosis, gliosis, myelin loss, perivascular cell infiltrations, and vasculitis. In BDV positive brain stem, cerebellum and mid-brain tissue sections, a rabbit polyclonal BDV antibody commercial and rabbit polyclonal anti caspase 3, caspase 9, Bcl-2, TNFR1, TNF-?, INF-?, eNOS, iNOS, and GFAP antibodies were employed. Number of apoptotic cells was determined by TUNEL method and myelin loss was determined histochemically by LFB staining. According to immunoperoxidase test results, the percent area of caspase 9, Bcl-2, TUNEL, GFAP, eNOS and iNOS immunopositive staining was higher in BDV infected tissues compared to control (p<0.05). However, no significant differences were found for TNFR1, TNF-? and INF-? immunostainings between BDV infected and control tissues (p>0.05). There was a consistency between the intensity of regenerations based on the score of myelin loss and GFAP tests and severity of infection. As a results, the most remarkable result was that the brain eNOS and iNOS expressions is positively correlated with the severity of the disease that is compatible with the expression of apoptotic markers in BDV infections. The results also indicated that among the BDV infected cells, apoptotic cells mainly prefer the intrinsic pathway and the highest effect on the intrinsic pathway is most likely related to nitric oxide levels.