Oleik ve linoleik asidin in vitro sığır embriyo gelişimi ve kalitesine etkileri

Abstract

Bu çalışma, doymamış yağ asitlerinden oleik asit (18:1 cis-9- oktadekadienoik asit) ve linoleik asidin (18:2 (n?6), 9,12- oktadekadienoik asit) sığır embriyolarının in vitro gelişimi üzerine etkilerini araştırmak amacıyla gerçekleştirildi. Çalışmada kullanılan ovaryumlar, Ankara iline bağlı Çubuk ilçe mezbahasından temin edildi. Toplanan 198 adet ovaryumdan aspirasyon yöntemiyle, 1304 adet oosit elde edildi. Ancak bu oositlerden A ve B kalitede olduğuna karar verilen 1124 adedi çalışmada kullanıldı.Maturasyon, kapasitasyon, fertilizasyon ve embriyo kültürü işlemleri %5 CO2 ve %95 nem içeren 38,5 oC'lik inkübatör ortamında gerçekleştirildi. Maturasyon medyumu olarak doku kültür medyumu 199 (TCM-199) kullanıldı. Bu medyumdan 100 µL'lik maturasyon mikrodamlaları hazırlandı. Damlaların üzeri mineral yağ ile kapatıldı. Her mikrodamlaya ortalama 18'er adet oosit yerleştirildi. Oositler, maturasyon amacıyla 22 saat süreyle inkübe edildi. Kumulus ekspansiyonu görülen oositler mature kabul edildi.Spermatozoonların kapasitasyonu amacıyla heparin (5 U/mL) ve kafein (2 mM) içeren Brackett ve Oliphant (BO) medyumu kullanıldı. Spermatozoonlar 25000/oosit olacak şekilde doze edildi. Oosit ve spermatozoonlar fertilizasyon amacıyla 6 saat inkübe edildi. Ardından Charles Rosecrans (CR1aa) embriyo kültür medyumu ile yıkanan oositler, oleik asit (10 µM, 100 µM ve 1000 µM) ve linoleik asit (10 µM, 100 µM ve 1000 µM) içeren CR1aa medyumunda inkübasyona kaldırıldı. İnkübasyonun 48. saatinde ilk bölünme kontrolü yapıldı. Fertilizasyonu takip eden 168. saatte ise morula-blastosist aşamasına gelen embriyolar tespit edildi. Verilerin istatistiksel analizi khi-kare yöntemiyle yapıldı. Zigotun bölünme oranları; kontrol grubu için %53,64, linoleik asit için %62,59 (10 µM), %50,00 (100 µM) ve %58,55 (1000 µM), oleik asit için ise %62,25 (10 µM), %64,29 (100 µM) ve %71,70 (1000 µM) olarak bulundu. Gruplar arasında yapılan karşılaştırmada, 1000 µM oleik asidin diğer deneme gruplarına göre daha etkili olduğu görüldü (p<0,01). Bölünme oranları ortalaması ise linoleik asitte %57,11, oleik asitte %66,16 olarak bulundu.Zigotun morula-blastosist evresine ulaşma oranları, kontrol grubunda %13,25, linoleik asit için %23,13 (10 µM), %11,81 (100 µM) ve %21,05 (1000 µM), oleik asit için ise %25,17 (10 µM), %28,57 (100 µM) ve %34,59 (1000 µM) olarak bulundu. Morula-blastosist evresine ulaşma ortalaması ise linoleik asitte %18.74, oleik asitte %29,53 olarak hesaplandı.Sonuç olarak, Oleik asitin her üç dozunun zigotun bölünme oranını ve ortalamalarını, morula-blastosist evresine ulaşma oranını ve ortalamalarını arttırdığı ve in vitro embriyo kültüründe antioksidan olarak kullanılabileceği kanısına varıldı. Oleik asidin 1000 µM'lik dozunun en iyi sonucu verdiği görülmüştür. Linoleik asit ile yapılan karşılaştırmalarda oleik asidin anılan parametreler yönünden daha etkili olduğu saptandı.

The objectives of this study were to examine effects of unsaturated fatty acids oleic acid (18:1 cis-9-octadecenoic acid) and linoleic acid (18:2 (n?6) 9,12- oktadekadienoik asit), on in vitro bovine embryo development. All of the ovaries were collected from Cubuk slaughterhouse in Ankara. A total of 1304 oocytes were collected from 198 ovary by aspiration methods, but only 1124 oocytes evaluated as A and B quality were used.Maturation, capacitation, fertilization and embryo culture were performed under 5% CO2 and 95% air in 38.5 oC incubator. TCM-199 was used as maturation medium. Maturation microdrops (100 µL) were prepared using this medium. Drops were covered by mineral oil then 18 oocytes were put into the each drop. Oocytes were then cultured for 22 hours in the incubator. Oocytes having cumulus expansion were accepted as matured.Brackett and Oliphant (BO) medium containing (5 U/mL) heparin and (2 mM) caffeine was used for spermatozoa capacitation. Number of spermatozoa was adjusted to 25000/oocytes for final concentration. Oocytes and spermatozoa were incubated together for 6 hours in the incubator for fertilization. After washing the oocytes in Charles Rosenkrans1 amino asit (CR1aa) they were incubated in CR1aa medium containing oleic acid (10 µM, 100 µM, 1000 µM) and linoleic acid (10 µM, 100 µM, 1000 µM). Oocytes were inspected for cleavage incubation after first 48 hours and cleavaged. Morula-blastocyst stages were observed 168 hours after the fertilization. Data were analysed by chi-square test. Cleavage rates of zygotes were calculated as 53.4% for control group, 62.59% (10 µM), 50.00% (100 µM), 58.55% (1000 µM) for linoleic acid and 62.25% (10 µM), 64.29% (100 µM) and 71.70% (1000 µM) for oleic acid. Comparing the other groups, 1000 µM oleic acid was more effective (p<0.01) than other experimental groups. The average cleavage rates were 57.11% and 66.16% for linoleic acid and oleic acid respectively.The morula-blastocyst rates were 13.25% for control group, 23.13% (10 µM), 11.81% (100 µM), 21.05% (1000 µM) for linoleic acid; 25.17% (10 µM), 28.57% (100 µM) and 34.59% (1000 µM) for oleic acid. The average morula-blastocyst rates were calculated as 18.74% for linoleic acid and 29.53% for oleic acid.As a result, It has turned out that all three doses of oleic acid increased the ratio and averages of zygot cleavage and reaching to morula-blastocyte stage respectively and it was concluded that it can be used as an antioxydant in invitro embryo culture. The best result was obtained from the dose of 1000 µM oleic acid. By comparing to linoleic acid, it was deduced that oleic acid is more effective regarding aforementioned parameters.