Aljinat ile mikroenkapsülasyonu yapılan primer kondrositlerin hidrojel içi ve dışı kondrojenik potansiyelleri

Abstract

Kıkırdak dokusunun tamir yeteneği oldukça sınırlıdır. Bu nedenle, osteoartritis gibi dejeneratif eklem hastalıklarında, hasarlı bölgelere taşıyıcı matriksler içinde kondrosit implantasyonu yapılması en güncel yaklaşımlar arasında yer alır. Bununla birlikte, implantasyon sonrası kondrositlerin korunması, taşıyıcı matriksin biyouyumluluğu ve stabilitesi konularında, yoğun olarak araştırmalar devam etmektedir. Mitojenik kapasiteleri sınırlı olan kondrositler, hücre kültüründe bölünme yeteneği kazanırlar ve kollajen tip II yerine kollajen tip I sentezlemeye başlarlar. Bu şekilde, fibroblast benzeri yapıya dönüşmüş olan kondrositler, hasarlı bölgeye aktarılmadan önce kondrojenik kapasitelerini geri kazanabilmeleri için 3 boyutlu taşıyıcı matrikslere alınırlar. Ancak, kondrojenik potasiyeli tam anlamıyla koruyan bir mekanizma bugüne kadar geliştirilememiştir. Son yıllarda kondrositlerin yarı geçirgen zarlarla mikrokapsülasyonu, kıkırdak doku mühendisliği alanında yeni teknik ve teknolojilerin gelişmesini sağlamıştır. Sunulan tezde aljinat ile mikrokapsülasyonu yapılmış primer sığır kondrositlerin, kondrojenik potansiyeli geri kazanımlarının ortaya konulması amaçlanmıştır. Bu çalışmada, sığır fetusu hyalin kıkırdak dokusundan izole edilen primer kondrositlerden hücre kültürü yapılmıştır. Daha sonra aljinat ile mikrokapsülasyonu yapılmış ve yapılmamış kondrositler 40 gün boyunca kültür ortamında bekletilmiştir. Kültürün 5, 8, 15, 30 ve 40'ncı günlerinde alınan hücrelerin kondrojenik kapasiteleri histolojik, histokimyasal, immunohistokimyasal yöntemlerle detaylı olarak ortaya konulmuştur. Bu amaçla; apoptoz/nekroz testi, MTT sitotoksisite testi, GAG depolanmasını göstermek için toluidine blue boyaması, kollajen tip I ve kollagen tip II için immunohistokimya analizleri yapılmıştır.Tüm örnekler 3 tekrarlı çalışılmıştır ve sonuçlar istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. Sonuç olarak, kapsüllenen kondrosit hücreleri 40. güne kadar canlılıklarını büyük ölçüde devam ettirmişlerdir. Apoptoz nekroz için yapılan ikili boyama testinde 5. gününde kapsüllenmiş hücrelerin apoptoz/ nekroz oranı %3,03/ %0,61 iken, 8. günde %5,45/ %1,82, 15. günde %5,65/ %3,23, 30. günde %16,39/ % 14,75 ve 40. günde %17,31/ %16,54 olarak hesaplanmıştır. Ayrıca yapılan MTT sitotoksisite testinde canlılık oranı 5. günde %91,37, 8. günde %84,32, 15. günde %81,17, 30. günde %77,65 ve 40. günde %61,30 olarak kaydedilmiştir. GAG sentezinin belirlenmesi için yapılan toluidin boyamada ve DMMB analizinde sentezin gerçekeştiği gösterilmiş ve Real-Time PCR çalışması sonucunda ise tip II ve SOX9 genlerinin ekspresyonuna rastlanmamıştır.

Cartilage tissue has a limited capacity of repair. Mainly for this reason, chondrocyte implantation via carrier matrices to damaged cartilage areas is among the most current approaches in degenerative joint disease such as osteoarthritis. Chondrocytic condition as well as biocompatibility and biodegradation of the carrier matrices are still of scientific interest to a high degree. Chondrocytes, which normally have a limited mitogenic capacity, gain capacity of proliferation and synthesize collagen type I instead of collagen type II in 2 dimensional cell culture environment (dedifferentiation). Dedifferentiated chondrocytes are loaded to 3 dimensional matrices in order for them to regain chondrogenic capacity before implantation to damaged cartilage regions. However, absence of a mechanism that fully fosters and protects chondrogenic potential is the main reason behind this ongoing interest. Microcapsulation of chondrocytes with a semi permeable membrane has been studied for the last few years and opened doors for new technology opportunities in cartilage tissue engineering. In this proposed study, primary bovine chondrocytes were microcapsulated with alginate. Bovine chondrocytes, isolated from fetal cartilage provided from a local slaughterhouse, were expanded in cell culture. Chondrocytes either microcapsulated or uncapsulated will be cultured for at least 40 days. The chondrogenic capacity was revealed in sampled chondrocytes at the 5, 8, 15, 30, and 40. days of the culture using histological, histochemical, immunohistochemical techniques. For this purpose, apoptosis/necrosis test, MTT cytotoxicity test, toluidine blue staining for GAG deposition and immunohistochemistry for collagen type I and collagen type II were done. All samples will be studies in triplicate and results will be evaluated statistically. As a consequence, viability of encapsulated chondrocytes continued at high levels until 40 days. According to results of double staining for apoptosis and necrosis, apoptosis/necrosis ratio of encapsulated chondrocytes in 5th day were calculated as %3,03/ %0,61, in 8th day %5,45/ %1,82, in 15th day %5,65/ %3,23, in 30th days %16,39/ % 14,75 , and 40th days %17,31/ %16,54 . Furthermore , according to MTT cytotoxicity test, viability ratio of capsulated chondrocytes were recorded as %91,37 in 5th day, %84,32 in 8th days, %81,17 in 15th day, %77,65 in 30th day and %61,30 in 40th day. In toluidine blue staining and DMMB assay for detecting deposition of GAG, synthesis were observed and type II and SOX9 genes expression were not observed with Real Time PCR analysis.