Yoğun bakım ünitesinde gelişen kandidemilerin klinik ve moleküler yöntemlerle erken saptanması

Abstract

Bu çalışmada Cerrahpaşa Tıp Fakültesi (CTF) yoğun bakım ünitelerinde (YBÜ) takip edilen kandidemi riski yüksek olan kritik hastalarda erken tanı için risk faktörlerinin belirlenerek özgün Candida skorunun oluşturulması ve deneysel modelleme ile tam kandan çalışılabilen moleküler bir yöntem olan Candida Real-Time PCR testinin geliştirilmesi amaçlandı. Çalışma üç aşamalı olarak dizayn edildi. Birinci aşamada YBÜ'de saptanan kandidemi olgularında risk faktörleri tanımlaması (Retrospektif Vaka-Kontrol çalışması), ikinci aşamada vaka kontrol çalışması verileri ile CTF Candida skor formu oluşturulması ve bu formun klinik etkinliğinin araştırılması (Prospektif kesitsel çalışma), üçüncü aşamadaysa tam kan örneklerinde PCR tabanlı bir hızlı tanı testi oluşturulması (Deneysel çalışma) planlandı.Ocak 2017 - Aralık 2018 tarihleri arasında CTF'de takip edilen 100 YBÜ hastası (50 vaka / 50 kontrol) kayıtlardan geriye dönük olarak incelendi. İntraabdominal infeksiyon (p = 0,001), son üç ayda hastanede yatış öyküsü (p = 0,006), bir haftadan uzun antibiyotik kullanımı (p = 0,005) ve Candida skoru (p <0,05) kandidemi için en önemli risk faktörleri olarak bulundu. CTF Candida skorunun 4 puan ve üzeri sınır değeri kandidemi için anlamlı bir risk oluşturduğu saptandı (p <0,05). Real-time PCR amplikonlarının erime eğrisi analizi ile C. albicans ve C. parapsilosis izolatlarını ayırt etmek için spesifik primer çiftleri ve EvaGreen boyası kullanıldı. ITS, D1/D2 bölgelerinin amplifikasyonu ile elde edilen amplikonun özgüllüğü gösterildi. PCR testimizin in vitro saptama limiti 10 CFU/ml olarak belirlendi.Sonuç olarak, çalışmamızda geliştirilen CTF Candida skoru ve PCR testi, konvansiyonel tanı yöntemleri ile birlikte, klinisyenlere YBÜ gibi kandidemi mortalitesinin yüksek olduğu birimlerde gereksiz antifungal kullanımından kaçınmak ve uygun antifungal tedaviye erken başlamak için rehberlik edebilir. Denenen PCR testinin duyarlılığını arttırmak için geliştirmeye ihtiyaç vardır. Klinik kullanımdaki etkinliğini doğrulamak için daha çok hasta sayısı ve daha fazla örneklem içeren çok merkezli çalışmalar yapılmalıdır.Anahtar Kelimeler: Kandidemi, Real-Time PCR, ITS bölgesi, D1/D2 bölgesi, Erime eğrisi analiziBu tez projesi İ.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir.

To evaluate the risk factors in critically ill patients who are followed up in intensive care units (ICUs), to create a unique Candida score, and to develop the Candida Real-Time PCR for early diagnosis of candidemia was aimed.The study was designed at three steps. We evaluated the risk factors in ICU patients with invasive candidiasis at the first step. At the second step, we created a unique Candida score and studied its clinical efficacy. Finally, at the third step, a rapid PCR-based test from whole blood samples was performed. One hundred ICU patients (50 case/50 control) followed at Cerrahpasa Medical Faculty between January 2017 and December 2018 reviewed retrospectively from records. Intraabdominal infection (p = 0.001), history of hospitalization in the last three months (p = 0.006), antibiotic use longer than one week (p = 0.005) and Candida score (p <0.05) found to be the most important risk factors for candidemia. The cutoff value of CTF Candida score of 4 points and above could determine a significant risk for candidemia (p<0.05). Specific primer pairs and EvaGreen dye were used to differentiate C. albicans and C. parapsilosis isolates via melting curve analysis of real-time PCR amplicons. The specificity of the amplicon obtained by amplification of the ITS, D1/D2 regions was shown. We found that 10 CFU/ml is the in vitro detection limit for our PCR test.In conclusion, CTF Candida score and PCR test developed in our study (with conventional diagnostic methods) can guide clinicians to avoid unnecessary antifungal use and start appropriate antifungal therapy early. Improvement is needed to increase the sensitivity of the developed PCR test. Multicenter studies with more patient numbers and more samples should be conducted to verify its effectiveness in the clinic.Keywords: Candidemia, Real-Time PCR, ITS region, D1/D2 region, Melting curve analysisThe present work was supported by the Research Fund of Istanbul University.