Engineering and systematic comparison of constitutive promoters in various lines of chinese hamster ovary cells
- Global styles
- Apa
- Bibtex
- Chicago Fullnote
- Help
Abstract
Son yirmi yılda, moleküler biyoteknolojideki gelişmelerin ardından, rekombinant biyoteknolojik ilaçların üretimi önemli ölçüde artmıştır. Çin hamsteri yumurtalık hücreleri endüstriyel biyoterapötiklerin üretiminde en çok tercih edilen memeli hücre ekspresyon sistemidir. Bu hücrenin avantajları süspansiyonda büyüyebilmesi, insan benzeri translasyon sonrası modifikasyonlar yapabilmesi ve iyi karakterize edilmiş transfeksiyon ve gen amplifikasyon sistemlerine sahip olmasıdır. Bu çalışmayı gerçekleştirmek amacıyla, rekombinant DNA teknolojisini kullanarak, yeni bir çift promotör raportör sistemi tasarladık. Bu sistem ile çeşitli CHO hücre hatlarında doğal viral, memeli ve endojen promotörleri en yüksek seviyede protein ekspresyonu için sistematik olarak karşılaştırıldı. İlk olarak, CHO-WT, CHO-DG44 ve CHO-DG44 süspanse hücre hatlarında promotör aday panelimizi (CMV, SV40, HSV TK, PGK, EFS, EF1a, UBC, CAG ve CHEF1a) test ettik. Lusiferaz analizi sonucunda, en yüksek raportör aktivitesini CMV promotöründe tespit ettik. Lusiferaz sonuçlarımızı, seçili dört promotörün akış sitometrisinde analiz edilmesi ile destekledik. Sonrasında, seçtiğimiz beş promotörü stabil hücre hatlarında karşılaştırmak amacıyla, DHFR içeren vektöre yerleştirdik. Stabil hücre hatlarının elde edilmesi halen devam etmektedir. Tamamlandığında, çift promotörlü sistemimiz ile güçlü beş promotörü uzun süreli hücre kültürü için karşılaştırabileceğiz. Sonuç olarak, çift promotör raportör sistemi, tipik olarak iki vektörün beraber verilmesinde görülen problemleri ortadan kaldırdı ve CHO hücrelerinde yüksek ekspresyon seviyeleri sağlayan güçlü düzenleyici elementleri tanımlamak için faydalı bir sistem olduğu kanıtlandı.Anahtar Kelimeler: CHO, rekombinant DNA teknolojisi, promotör gücü, çift promotörsistemi Following the developments in molecular biotechnology over the past two decades, the production of recombinant biological drugs has increased significantly. Chinese Hamster Ovary (CHO) cells are essentially the most preferred mammalian cell expression system for industrial manufacturing of biotherapeutics because of easy adaptation to grow in suspension, human-like post translational modifications and well-characterized transfection and gene amplification systems. In the present study, using recombinant DNA technology, we engineered a novel all-in-one dual-promoter reporter system to systematically compare the strength of natural viral, mammalian and endogenous promoters for high level of protein expression in various lines of CHO cells. We firstly studied a large panel of candidate promoters (CMV, SV40, HSV TK, PGK, EFS, EF1a, UBC, CAG and CHEF1a) in CHO-WT, CHO-DG44 and CHO-DG44 suspension cell lines for transient gene expression. Of nine promoters, luciferase assay revealed that CMV achieved the highest reporter activity. We supported our luciferase assay results via repeating the comparison of three strong promoters and one weak promoter with flow cytometry. Then, five strongest promoters were selected and placed on the backbone having mouse DHFR coding sequence to test the promoter strength in stably transfected cells. The recovery of stable cells is still in progress. So, after recovery, we will be able to compare these five strong promoters with our dual promoter system in long term culture. Conclusively, the dual-promoter reporter system eliminated the problems in co-transfection assays and proved to be a useful system to identify strong regulatory elements ensuring high levels of expression in CHO cells.Key Words: CHO, recombinant DNA technology, promoter strength, dual promoter system
Collections