Analysis of the mitotic kinase functions by chemical genetics approaches
- Global styles
- Apa
- Bibtex
- Chicago Fullnote
- Help
Abstract
Mitoz, hücre döngüsünün en kısa evresi olmasına rağmen hücresel yapı ve işlevlerde çok büyük değişiklikleri içerir. Mitoza giriş ve ilerleme, sinyal yolaklarından oluşan ağların ve otoamplifikasyon döngülerinin dinamik işleyişleriyle garantilenmektedir. Mastl kinaz, protein fosfataz 2A'yı (PP2A) dolaylı olarak inhibe ederek, mitoz sırasında mitotik substratların hiperfosforile hallerinin korunmasını sağlar. Mastl kinaz için yapılan gen yok etme çalışmaları; hücrelerde kromozomların ayrılmasında kusur ve bunun sonucu olarak sitokinezin gerçekleşememesi ve mitotik substratların fosforilasyon düzeylerinde azalmalar göstermiştir.Mastl kinazın mitotik fonksiyonlarının daha iyi anlaşılabilmesi ve karakterize edilebilmesi için; enzimin analog duyarlı varyantlarını oluşturmayı amaçladık. Öncelikle insan hücre hatlarında, endojen Mastl lokusuna CRISPR-Cas9 metoduyla ilgili mutasyonların yerleştirilmesi amaçlandı. Başarısız denemelerin ardından çalışmaları koşullu knockout fare embriyonik fibroblast hücrelerinde yapmaya karar verdik. Retroviral vektörler aracılığıyla, analog duyarlı kinaz varyantlarını ekzojen olarak ekspresse ettik ve oluşturulan stabil hücre hatları, endojen Mastl lokusunun delesyonu için indüklendiler. Amacımız, ATP'yi bağlayabilen ve normal kinaz aktivitesi veren ve buna ek olarak bir ATP analoğu inhibitörüne duyarlı olan bir enzim oluşturmaktı.Çalışmanın son durumunda, knockout indüklenmiş stabil hücre hatlarının sağlıklı olmadığını gözledik. Mutasyonlarının enzim aktivitesine olası olumsuz etkilerinden ve yetersiz seviyede ektopik ekspresyondan şüphelendiğimiz için, azalan enzimatik aktiviteyi daha yüksek ekspresyon düzeyleriyle telafi edebilmek amacıyla, lentiviral expresyon sistemlerine geçiş sürecinde ön denemeler yapılmaktadır. Mitosis is the shortest phase of the cell cycle yet it involves dramatic changes in the cellular architecture and processes. Mitotic entry and progression are tightly regulated by the dynamic actions of signaling pathway networks and autoamplification loops. Mastl kinase is responsible for preservation of the hyperphosphorylated state of the mitotic substrates by indirectly inhibiting the major antagonist protein phosphatase, PP2A. Loss of function studies of Mastl kinase have shown defects of chromosomal segregation and subsequent failure of cytokinesis, and underphosphorylation of the mitotic substrates.To better understand and further characterize the mitotic functions of Mastl kinase, we aimed to engineer its analogue-sensitive mutant variants. We initially worked on editing the endogenous loci in human cell lines using CRISPR-Cas9 system. After failed attempts of editing the endogenous loci, we decided to use the conditional knockout mouse embryonic fibroblasts. Using retroviral vectors, we ectopically expressed the mutant variants of mouse Mastl and deleted the endogenous loci by inducing knockout in these stable cell lines respectively. Our eventual aim was to create an enzyme that will bind ATP and have normal kinase activity, and yet, be sensitive to an ATP analogue inhibitor.As a result, we observed that the stable cell lines are not viable when knockout was induced. We suspect the possible negative impacts of the mutations on enzymatic activity and insufficient ectopic expression levels. In order to compensate for this possible partial enzymatic inactivation, we are currently switching to lentiviral expression systems to achieve higher expression levels.
Collections