İnsan sperm akrozinin saflaştırılması ve bazı kinetik özelliklerinin incelenmesi

Abstract

6.ÖZET Akrozln (E.C. 3.421.10), İnsan sperm akrozoml arından ekstre edildi. `Saphadex G-75 superfine kolon` kromatografls! kullanılarak % 73.8 verimle 35 kez saflaştınldı. Enzim preparatının saflığı; SDS/PAGE yöntemi ile gösterildi. Saflaştmlan akrozln 50.000 daltona karşılık gelen tek bir protein bandı verdi. Saflaştmlan enzimin, BAEE substratı için Km ve Vmax değerleri sırasıyla 5.97 xl0`5 M ve 82.2 mü/ml/dak bulundu. Akrozinln, 25 °C'den daha yüksek ısıdaki Inkübasyonlara oldukça duyarlı olduğu saptandı. Optimum pH değeri 8.0 olarak bulundu. Bu çalışmada, saflaştınlan enzime, bir (Na+, K+, L1+) ve iki (Zn2+, Cu2+, Ca2+) değerli katyonların, fruktozun ve nltrozolu bileşiklerden NPYr ve NMOR'in in vitro etkileri incelendiğinde; çinko, NPYr ve NMOR'in enzimi nonkompetltif, fruktozun ise; karışık tip inhlbisyon şeklinde inhibe ettikleri bulundu. Kalsiyum iyonlarının ise; enzimi aktive ettiği gözlendi.94 K1(%50 inhlbisyon için gerekil Inhibitor derişimi) değerleri fruktoz, çinko, NPYr ve NMOR için sırasıyla 150 mM, 1.6 mM, 1.5 mM ve 3.5 mM olarak bulundu. Diyaliz ve TLC yöntemleriyle NPYr ve NMOR 'in enzime ve BSA'ya TLC yöntemi ile de bazı amino asitlere (Fenilalanin, tirozin, triptofan, histidin, prolin, sistein, metionin, arginin) bağlandığı gösterildi.

7.SUMMARY Acrosin (E.C.3A21.10) was extracted from human sperm acrosomes. Acrosin was purified 35 times by using `sephadex G-75 superfine` column choramatography with a 73.8 % yield. The purity of enzyme preparation was shown by SDS/PAGE method. Purified acrosin gave only one protein band with a 50.000 dalton MW. The Km and Vmax values of the purified enzyme were found to be 5.97x1 0_5M and 82.2 mU/ml/min, respectively, by using BAEE substrate. It was observed that acrosin activity was decreasing rapidly above 25 °C. Optimum pH value was found to be 8.0.96 When the In vitro effects of mono (Na+, K+, Li+) and divalent Zn2+, (Cu2+, Ca2+) cations, fructose and nitroso compounds such as NPYr and NMOR on the purified enzyme were investigated, zinc, NPYr and NMOR were found to Inhibit the enzyme noncomptetltlvely, whereas fructose was found to produce a mixed- type of Inhibition. 50 mM concentrations calcium Ions activated the enzyme. Ki values (Inhibitor concentration required for 50% Inhibition) for fructose, zinc, NPYr and NMOR were 150 mM, 1.6 mM, 1.5 mM and 3.5 mM respectively. NPYr and NMOR were shown to bind to the enzyme and BSA by using dialysis and TLC methods, and also to the amino acids (proline, cysteine, methionine, arginine, phenilalanine, tyrosine, tryptophan, histidine) by TLC method.