Antik insan ve Kuzeydoğu Anadolu step filinin (elephas trogontherii-mamut) kemiklerinde alkalen fosfataz enziminin aranması ve tanımlanması

Abstract

ÖZET Bu çalışmada, alkalen fosfataz enzimi (AP) antik insan kemiklerinden total olarak ve antik fil kemiğinden bağlanma şekillerine göre dış periferal, sitozolik, iç periferal ve integral olmak üzere dört basamakta ayrı, ayrı saflaştınldı ve karakterize edildi. 3000 yıllık antik insan kemiklerinden total olarak alkalen fosfataz enzimi jel fıltrasyon ve iyon değişim kromatografisi kullanılarak saflaştınldı. Daha sonra yaşı yaklaşık olarak 300.000 ile 800.000 yıl arasında tahmin edilen Kuzeydoğu Anadolu Step Fil'inin (Elephas Trogontherii) kemiklerinden bağlanma şekillerine göre dört basamakta alkalen fosfataz izoenzimleri iyon değişim kromatografisi ile saflaştınldı. Bu izoenzimlerin aktiviteleri substrat olarak p-nitrofenilfosfat kullanılarak tayin edildi. Saflaştırılan AP izoenzimlerinin optimum pH'ları ve optimum sıcaklıkları belirlendi. Ca+ iyonunun ve tonocalsinin (kemik erimesi hastalığının tedavisinde kullanılan bir ilaç) AP aktivitesi üzerine etkisi araştırıldı. Bütün izoenzimlerin molekül ağırlıkları jel fıltrasyon kromatografisi ile belirlendi. Ayrıca Linevveaver-Burk grafikleri metodu kullanılarak bu AP izoenzimlerinin Vmax ve Km değerleri bulundu. Elde edilen bu sonuçlardan yararlanılarak antik insan kemiğinden AP enzimi ve antik fil kemiğinden elde edilen dış periferal, sitozolik, iç periferal ve integral AP izoenzimleri saflaştırılıp, karakterize edildi.

II SUMMARY Human bone alkaline phosphatase was isolated and its characteristic features were determined. In according to bonding forms, AP enzymes were separately purified and characterized at four steps from steps elephant (Elephas Trogontherii) as outer peripheral, inner peripheral, integral and cytosolic. Using gel filtration and anion exchange chromatography purified human bone alkaline phosphatase enzyme that aged 3000 years. 0,3-0,8 million years aged elephant bone alkaline phosphatase isoenzymes was purified by using anion exchange chromatography. The activity measurement of these izoenzymes was used by using p- nitrophenylphosphate as substrate. The optimum pH and the optimum temperatures of AP izoenzymes were determined. The behaviors of AP against Ca+2 and tonocalsin has been investigated. The molecular weight of all enzymes was determinated by using gel filtration. Also Vmax and Km values of purified isoenzymes from human and elephant bone were found by using Lineweaver-Burk method. Human bone AP and elephant bone AP izoenzymes were characterized based on the obtained results.