Farklı memeli sütlerinden laktoperoksidaz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu, suda çözünen organik çözücülerdeki davranışı, sekonder ve tersiyer hidroperoksitleri indirgeme kinetiğinin incelenmesi

Abstract

ÖZET Doktora Tezi FARKLI MEMELÎ SÜTLERİNDEN LAKTOPEROKSİDAZ ENZÎMÎNİN SAFLAŞTIRILMASI, KARAKTERİZASYONU, SUDA ÇÖZÜNEN ORGANİK ÇÖZÜCÜLERDEKÎ DAVRANIŞI, SEKONDER VE TERSİYER HİDROPEROKSİTLERİ İNDİRGEME KİNETİĞİNİN İNCELENMESİ Halil İbrahim HACIBEYOĞLU Atatürk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Ö. İrfan KÜFREVİOĞLU Ortak Yönetici: Yrd. Doç. Dr. Hamdullah KILIÇ Bu çalışmada laktoperoksidaz enzimi (LPO)(E.C. 1.1 1.1.7) sağlıklı sığır, manda ve koyun sütlerinden biyokimyasal ve kromatografik yöntemler kullanılarak saflaştırılmış ve bazı kinetik özellikleri araştırılmıştır. Laktoperoksidaz enziminin belirtilen memeli sütlerinden saflaştırılması amacıyla, Amberlite CG-50 H+ reçinesiyle kısmı saflaştırma yapılarak, CM- Sephadex C-50 iyon değişim kromatografisi, %0-90 amonyum sülfat çöktürmesi, Sephadex G- 100 jel filtrasyon kromatografisi, diyaliz ve enzim saflığını kontrol etmek amacıyla SDS- PAGE elektroforezi teknikleri kullanıldı. Bir litre sığır sütünden spesifik aktivitesi 22.72 EÜ/mg protein olan toplam 6.6 mg LPO, manda sütünden spesifik aktivitesi 23,1 EÜ/mg protein olan toplam 7,54 mg LPO ve koyun sütünden spesifik aktivitesi 3,36 EÜ/mg protein olan toplam 5,74 mg LPO elde edildi. Bu üç enzim için optimum pH, optimum sıcaklık ve ABTS substratı için Km ve VMax değerleri belirlendi. Suda çözünebilen organik çözücülerin enzim üzerindeki inhibisyon etkisi incelendi. ABTS ve H202 substratları kullanılarak yapılan çalışmalarda kullanılan çözücülerin tamamının enzimi inhibe ettiği ve inhibisyon tipinin yarışmalı inhibisyon olduğu bulundu. Kullanılan çözücüler içinde, metanol ve etanol'ün enzimi en az inhibe ettiği bulundu. Organik peroksitlerin enzim üzerindeki etkilerini incelenmek üzere organik peroksitler sentezlendi ve ABTS substratı için KM ve VMax değerleri bulundu. LPO enziminin sekonder ve tersiyer organik peroksitlere ilgisinin olduğu, fakat bu ilginin H202 ile karşılaştırıldığında çok düşük olduğu bulundu. 2002, 149 sayfa Anahtar kelimeler: Laktoperoksidaz, kinetik, inhibisyon, organik çözücü, organik peroksit.

ABSTRACT Ph.D.Thesis PURIFICATION AND CHARECTERIZATION OF LACTOPEROXIDASE FROM DIFFERENT MAMMALIANS MILK: INVESTIGATION OF LPO BEHAVIOR IN WATER- MISCIBLE SOLVENTS AND REDUCTION KINETICS OF SECONDER AND TERTIARY HYDROPEROXIDASES Halil Ibrahim HACIBEYO?LU Atatürk University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor: Prof.Dr.Ö.İrfan KÜFREVÎO?LU Co-Advisor: Yrd. Doç. Dr. Hamdullah KILIÇ Lactoperoxidase was purified from healthy mammalian animals milk (bovine, water buffalo, sheep) by using biochemical and chromatographic techniques and some kinetics properties have been investigated. For the purification of LPO milk was first treated with Amberlite CG- 50 H1` resins and later ammonium sulphate precipitation. CM-Sephadex C-50 ion exchange chromatography, Sephadex G-100 gel filtration chromatography and dialyze were employed, respectively. Enzyme purity determined by SDS-PAGE electrophoresis. 6.6 mg LPO from bovine milk (specific activity 22.72 EU/mg protein), 7.54 mg LPO from water buffalo milk (specific activity 23;10 EU/mg protein ), 5.74 mg LPO from sheep milk (specific activity 3.36 EU/mg protein) per liter were obtained. For the obtained enzyme optimum pH and temperature were determined and KM and VMax values were measured in the presence of ABTS and H202 as substrates. Behaviour of LPO in water-miscible solvents has been investigated and water- miscible solvents have been found to inhibit LPO. Inhibition type was found to be competitive. Among the water-miscible solvents, methanol and ethanol were less effective than others. Some organic peroxides were synthesed and KM and Vmax values were determined in the presence of ABTS. LPO activity on organic peroxides was found to be very low when compared with H2 02. 2002, 149 pages Keywords; Lactoperoxidase, kinetics, inhibition, organic solvents, organic peroxides. 11