Bacillus Thuringiensis Serotiplerinin belirlenmesinde faj DNA problarının kullanım olanaklarının araştırılması

Abstract

1 ÖZET Doktora Tezi BACİLLUS THURİNGİENSİS SEROTİPLERİNİN BELİRLENMESİNDE FAJ DNA PROBLARININ KULLANIM OLANAKLARININ ARAŞTIRILMASI* Ayten ÖZTÜRK Ankara Üniversitesi- Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilimdalı Danışman: Prof.Dr. M.Lütfü ÇAKMAKÇI 1996, Sayfa: 111 Jüri : Prof.Dr. M.Lütfü ÇAKMAKÇI Prof.Dr. Velittin GÜRGÜN Prof.Dr. Nilüfer AKSÖZ Bu çalışmada Pasteur Enstitüsü'ndeh temin edilen 33 adet Bacillus thuringiensis serotipi kullanılarak Türkiye'nin çeşitli bölgelerinden toplanan toprak ve su örneklerinden 70 adet faj izole edilmiş ve daha sonraki çalışmalar için bu izolatlardan iki adedi seçilmiştir. Bu fajlardan S3<j> ve G9<j> fajlannın konak spektrumlan, morfolojik özellikleri ve genomik DNA'larının restriksiyon enzim (Eco Rl ve Hind III) analizleri yapılmış ve biyotinle işaretlenen DNA'larının prob olarak kullanılma olanakları araştırılmıştır. B.thuringiensis suşları sporulasyon aşamasında çeşitli böcek türlerine karşı toksik etkili kristal protein üretmekte ve bu nedenle biyokontrol ajanı olarak kullanılmaktadır. Bu çalışma sonucunda S3<£ fajının virulan bir faj olduğu ve 33 adet B.thuringiensis serotipinin % 90'ını litik olarak etkilediği, buna karşın G9<j> fajının ılımlı bir faj olduğu ve tüm serotiplerin % 9'unu litik olarak etkilediği belirlenmiştir. Geçişli elektron mikroskop ile yapılan morfolojik incelemelerde S3^ fajının ikozahedron kapsidli ve kontraktil olmayan bir kuyruğa sahip olduğu, buna karşın G90 fajının ikozahedron kapsidli ve kuyruksuz yeni bir faj olduğu tespit edilmiştir. Eco Rl ve Hind III enzimi ile yapılan restriksiyon endonükleaz analizleri, S30 fajının yaklaşık olarak belirlenen 22.5 Kb'lik genomik DNA'sının sırasıyla 9 ve 8 adet fragmente ayrıldığını, buna karşın G9<£ fajının, yaklaşık olarak belirlenen 29 Kb'lik genomik DNA'sının sırasıyla 9 ve 1 1 adet fragmente ayrıldığını göstermiştir. Lizojen B.thuringiensis suşlarının gelişme özelliklerinin, plasmidini kaybetmiş kristalsiz veya sporsuz ya da hem kristalsiz hem sporsuz B.thuringiensis suşlarının gelişme özelliklerine benzediği tespit edilmiştir. G9<£ fajıyla lizojen B.thuringiensis suşlarının, antibiyotik dirençliliklerinin değiştiği ve sporlanma aşamasına geçerken spontan olarak lize oldukları da belirlenmiştir. S30 ve G9<£ fajlannın biyotinle işaretli DNA problarıyla yapılan dot blot hibridizasyon reaksiyonlarında 33 adet B.thuringiensis serotipinden 9'unun G9<£ probuyla pozitif reaksiyon verdiği bulunmuştur. Ayrıca hibridizasyon reaksiyonları sonucunda S3<£ faj DNA'sı ile G9<£ faj DNA'sı arasında homolojinin bulunmadığı gösterilmiştir. ANAHTAR KELİMELER: Bacillus thuringiensis, bakteriyofaj, DNA, prob, hibridizasyon * Bu araştırma, Ankara Üniversitesi Araştırma Fonunca Desteklenmiştir.

S! ABSTRACT Ph.D. Thesis DETERMINATION AND DIFFERENTIATION POSSIBILITY AMONG STRAINS AND SEROTYPES OF BACILLUS THURINGIENSIS BY PHAGE DNA PROBES* Ayten ÖZTÜRK ^ Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engeenering Supervisor: Prof.Dr. M.Lütfü ÇAKMAKÇI 1996, Page: 111 Jury : Prof.Dr. M.Lütfü ÇAKMAKÇI Prof.Dr. Velittin GÜRGÜN Prof.Dr. Nilüfer AKSÖZ In this study, 70 phages were isolated from water and soil samples collected different parts of Turkey 33 Bacillus thuringiensis serotypes obtained from Pasteur Institute. Of the total 70 phages, two were selected for further analyses. Host specificities, morphological characteristics, and restriction endonucleases fragmentation after cutting of the S3<£ phage DNA and G9<£ phage by EcoRI and Hind III were determined. The possibilities to use the biotinylated DNA of B.thuiingiensis phages, S3<t> and G9<£ DNA probes were investigated. The 5-endotoxins are insecticidal proteins in sporulation phase of B.thuringiensis strains and are used as biocontrol agents for several species of insect pests. It was found that phage S3<£ which affected 90 % of B.thuringiensis serotypes was a virulent phage and G9<£ phage which affected 9 % of B.thuringiensis serotypes was a temperate phage. Morphological investigation with transmission electron microscope showed that phage S3<£ had a icosahedron head and non-contractile tail and phage G9<£ that novel phage of B.thuringiensis had a icosahedron head, and no tail. Analyses of restriction endonuclease for Eco Rl and Hind III showed that DNA of phage S3<£, approximate lenght of which was 22.5 Kb, was seen to contain 9 and 8 fragments, whereas DNA from phage G9<j> approximate lenght of which was estimated to be 29 Kb, was degraded to 9 and 1 1 fragments respectively. Growth characteristics of B.thuringiensis lysogens resembled to acrystalliferous or asporogenic and both acrystalliferous and asporogenic B.thuringiensis strains because of the lack of their plasmids. The sensitivities of antibiotics of B.thuringiensis lysogens which contained prophage G9<£ changed and spontaneously released phage particles in cultures of the bacteria while passing to sporulation phase. The present study showed that 9 B.thuringiensis serotypes were lysogenic for phage G90 by employing dot blot hibridization techniques with a biotinylated DNA probes constructed with DNA from phage GQ<j> and S3<£. Moreover, it was demonstrated that between phage SZ<j> DNA and phage G9<£ DNA were no homology. KEY WORDS: Bacillus thuringiensis, bacteriophage, DNA, probe, hibridization. *This Research was supported by The Research Found of Ankara University.