Serin alkali proteaz geni SubC bacillus plasmidlerine klonlanarak rekombinant biyokatalizör ile alkali proteaz üretimi

Abstract

1 ÖZET Yüksek Lisans Ted SERİN ALKALt PROTEAZ GENİ SubC Badüta PLASMİDLERİNE KLONLANARAK REKOMBİNANT BıYOKATALİZÖR İLE ALKALİ PROTEAZ ÜRETİM I Nerml KALENDER Ankara Colvcnltesi Fen Bfflnüeri EnsötOsû Kimya M OhendbUğİ Anahtöm Dah Danışman: ProEDr. RTançcrÖZDAMAR Eş Danışman: DoçJ>r. Pınar ÇALDC 2000,232 sayfa Jflriî ProCDr. ILTunferözdamar Doc,Dr. Pmar Çalık ProtDr.Thanr Doğu ProtDr. Semra Kocabıyık ProtDr. Serpil Takaç '-ndüstrlyel enzimlerden serin alkali proteaz (SAP) Üretiminde verim ve seçlminiğuı arttırılması İrin enetik mühendisliği teknikleriyle farklı Badüus tDrierl geliştirilmesi amacıyla, yüksek SAP liretim otanslyeUne sahip olduğa bQlnen Badüus iichaûfarmis*U SAP üretiminden şortunla dan SubC geni nce pRS316 ELcoU-yeast shuttle plasmlde klonlannuş sonra da pHVI431 E.coE-Badüus shuttle ılasmlde sob-klonkuna yapılnuş ve elde edilen reknmblnant plasmld Sn6C+pHVl431, NRRL kültür nUekstyonundan getirtilen Bacillus ahei, Badüus ccrats, Badüus firmus, Badüta subtiüs, Badüus tmyfoUquefadens, Bacillus badîta, Badüus spkaerieus ve Bacilku coagulans** aktarılarak farklı «kombinan! Bacillus türleri elde edilmiştir. SAP genini taşıyan rekomblnant pîasmldin BaaBus Orlerine aktardmasutda B.coagulans dışındakilerde doğal transformasyon, Rcoagulans'te be doğal ransformasyonun başarısız olması Özerine elektroporasyon yöntemi kaUanılnusnr. Geliştirilen -ekombtnant BaaBus türleri De doğal fiadttus'lann ürettiği enzim aktivlteleri karşüaştırtldığında, SAP [eninin aktarılmasıyla SAP aktrriteslnln r-Aatef de 34 kat, r-B.cereus*to 42 kal, r-BJirmtıs'U 35 kat, -B.subala*te 33 kat, r-B.oıryloüauefadens'te 2 kat, r-B.sphaerİois'ta 101 kat ve r-Bcoagulaja't» 27 tat arttığı bulunmuştur. Genetik tekniklerle SAP üretimi Idn geliştirilen rekomblnant Bacillus türleri le labaratuvar ölçekli blyoreaktBrierde, SAP Üretim prosesi gerçekleştirilmiş ve karbon kaynağı olarak çullanılan glukozun Badüta türlerinin çoğalmasına, SAP üretimine etkisi araştırılmış, rekomblnant Vaciüus türlerinin çoğalma kinetiği, ürün ve yan-ürün dağılımları İncelenmiş; r-B.alvd/ r-ftcereuf, r- BJirmus, r-BJubtüh, T-B.amyloUquefttnetıst T-Rbadms, r-Bjphaeriats ve r-B-eoagulatts İrin sırasıyla /°532, 1073, 745, 686, 1611, 689, 822 ve 912 t'/cra* olarak belirlenen maksimum SAP akthitelerine arasıyla Cc= 10.0, 20.0, 7.0, 8.0, 20.0, 7.0, 6.0 ve 10.0 kg/m1 glukoz deriştmlerinde ulaşılmıştır. Rekombmant Badüus türlerinin çoğalma kinetiklerinin Monod Modeline oyduğa ve herWr mikroorganlzmanm proses süresince ortama salgıladığı van-urUnlerin nitelik ve nicelik açısından farklılıklar gösterdiği belirlenmiştir. Son olarak yüksek aktlvlte gösteren mikroorganizmalardan r- BJirmus De pDot Ölçekli sistemde Q»/V-=0J wm ve N-700 dk ' oksijen aktarım koşullan ve laboratuvar ölçek deneylerinde bulunan optimum koşullarda SAP üretimi gerçekleştirilerek blçek büyütmenin etkisi İncelenmiş; proses süresince çözünmüş oksijen ve pH*ın değişimi gözlenmiş, biyoreaktörden kalma süresine karşı alman örneklerle mikroorganizma derişimi, SAP aktlvitesl, girdi ve ürün derislmleri ölçülmüş ve proses boyunca dinamik yöntemle im faz baransal kütle aktarım katsayısı kıa ve mikroorganlzmanm oksijen tüketim hızı r0 belirlenmiştir. ANAHTAR KELİMELER: Serin alkali proteaz Üretimi, SubC geni, transformasyon, rekomblnant Badüus türleri, ürün dağılımları.

u ABSTRACT Master Thesis ALKALINE PROTEASE PRODUCTION USING RECOMBINANT BIOCATALVST BY CLONING SERINE ALKALINE PROTEASE GENE SubC TO BadBus PLASMIDS Nerm) KALENDER Anka» University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemical Engineering Supervisor : Professor RTanceröZDAMAR Co-Supervfaor : Associate Professor Pmar ÇALIK 2000,232 pages Jury i ProtDr. ILToncer Özdamar Doc.Dr. Pmar Çalık ProCDr. Timor Doğa ProtDr. Semra Kocabryık ProtDr. Serpil Takac Recombinant Bacillus species carrying SubC gate encoding serine alkaline protease (SAP) enzyme were developed In order to Increase the yield and selectivity In bloprocess for SAP production. Thus, by using genetic engineering techniques SubC gene was amplified from the chromosomal DNA of the wild type B.üchetujbrmis by using PCR technology; and then SubC gene was first cloned in pRS316 ELcoB-yeast shuttle plasmld, then sub-cloned to pHV1431 tZcoli-Badllus shuttle vector, and transferred to BaciBus alvâ, Bacillus cereus, BacWusJumus, Bacillus subtilis. Bacillus amytoiiquefaciens, BaciBus baalus, BaciBus spbamats and Bacillus coagulans. Except B.coagulans pHV1431+lS<ifrC was transferred to the Bacillus strains by free transformation; however, pHV1431+&i£C was transferred to B.coagulans by electroporanon technique. In the second phase, bloprocess experiments were conducted by the wild type and by the recombinant BaciBus strains in order to compare the production potential and yields. By cloning the yl/Y/4i/+SubC SAP activity Increased 34 folds In r-B.alvei, 42 folds In T-Bcerem, 35 folds r-B.Jirmw, 33 folds hi r- Rsubtius* 2 folds m r-B.amyloüquefaciemt 101 folds In r-Bsphaericm and 27 folds in r- B.caagulans in a defined medium with sole carbon source glucose. In the third phase, the effects of substrate concentration on glucose consumption rate, microorganism concentration, SAP activity, SAP concentration, amino acids and organic acids concentrations were Investigated. Maximum SAP activities of r'Bab>a/ r~B.cereust r-B.firmu3t r-BaubHus* r-Bamyloliquefadens, r-B.badius, r- B.sphaericus and r-B.coagulans were obtained respectively as AB532, 1073, 745, 686, 1611, 689, 822 and 912 U/cm1; and their optimum glucose concentrations were Cq=» 10.0, 20.0, 7.0, 8.0, 20.0, 7.0, 6.0 and 10.0 kg/m1, respectively. The growth kinetics of the r-BacUlus obeyed the Monod kinetics. In the forth phase of the research programme, pUof-scale bloreactor experiments were carried out using Q/V= 0.5 wm and N= 700 rain'1 oxygen transfer conditions with r-Bfirmus under optimum conditions that are found In laboratory scale experiments. The variations of the glucose, ceU, SAP activity and concentration were determined with respect to residence time; and with the application of the dynamic method the oxygen uptake rate r0 and oxygen transfer coefficients Kl» were determined during the course of the batch-bloprocess. KEY WORDS: Serine alkaline protease production, SubC gene, transformation, recombinant Bacillus species, prod net distributions.