Genetik mühendisliği ve metabolik yolizi mühendisliği teknikleriyle L-fenilalanin üretimi için biyoteknolojik proses geliştirilmesi

Abstract

ÖZET Doktora Tezi GENETİK MÜHENDİSLİĞİ VE METABOLİK YOLİZİ MÜHENDİSLİĞİ TEKNİKLERİYLE L-FENİLALANİN ÜRETİMİ İÇİN BİYOPROSES GELİŞTİRİLMESİ İlknur Şenver ÖZÇELÜC Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: ProtDr. H.Tunçer ÖZDAMAR Beş alt programdan oluşan doktora çalışmasının birinci evresinde, L-fenilalanin üretimi için biyoteknolojik proses geliştirilmesi amacıyla önce üretim potansiyeli olan mikroorganizma seçilmesi gerektiğinden, taranan mikroorganizmalar arasından, tanımlanmış bir ortamda en fazla L-fenilalanin üreten Bacillus subtilis NRRL-NRS 1315 (BS1315) seçilmiştir. Araştırmanın ikinci alt-programında, BS1315 üretim potansiyelini artırmak için ortam tasarımı yapılmış ve en uygun karbon kaynağı ve derişimi, azot kaynağı ve derişimi, N/C oram etkisi, katyonların etkisi ve derişimleri laboratuvar ölçek biyoreaktörlerde araştırılmıştır. L-fenilalanin yolizinin ilk girdileri olan fosfoenolprüvat (PEP) ve eritroz- 4-fosfat (E4P)'m ortama eklenmesi ile aromatik amino asit yolizine yapılan perturbatif etki araştırılmıştır. Metabolik yolizi analizi (MY A) doktora çalışmasının üçüncü alt-programını oluşturmuş; B.subtilis için 232 adet tepkimeden oluşan kompleks tepkime sistemi belirlenmiş, 184 bileşik için kütle korunum denklemlerinden oluşan matematik model kurulmuştur. E4P derişim etkisinin incelendiği deney verileri, ürün ve yan-ürün dağılımları kullanılarak denklem sisteminin çözülmesiyle hücreiçi tepkime hızları hesaplanmış; L-fenilalanin yolizinde darboğaz oluşturma potansiyeli olan tepkimeler bulunmuş ve L- fenilalanin yolizinde korizmat'tan prefenat'ın oluştuğu tepkimenin hızının en düşük olduğu yani birincil darboğazı bu tepkimenin oluşturduğu belirlenmiştir. Dördüncü alt-araştırma programında L-fenilalanin üretiminde verim ve seçimliliği artırmak için üç alt-programdan oluşan genetik mühendisliği (GM) araştırma programı ile L-fenilalanin biyotepkime yolizinde birincil darboğazı oluşturan hedef tepkimeyi katalizleyen korizmat mutaz enzimini kodlayan aroH geni önce pUC19 E.coli plasmidine klonlanmış, sonra da pMK4 B.coli-Bacillus shuttle plasmide sub-klonlama yapılmış ve rekombinant DNA pMK4

ABSTRACT PİlD. Thesis BIOPROCESS DEVELOPMENT FOR L-PHENYLALANINE PRODUCTION BY GENETIC ENGINEERING AND METABOLIC PATHWAY ENGINEERING TECHNIQUES İlknur Şenver ÖZÇEIİK. Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemical Engineering Supervisor : ProfDr. Tunçer H. ÖZDAMAR Bacillus subtilis (NRRL-NRS 1315: BS1315) that is an industrially important microorganism was selected among many species in a defined medium as L-phenylalanine (Phe) producer. In order to increase the production potential of BS1315 a defined bioprocess medium based on glucose was designed and the optimum pH and temperature, and the effects of carbon and nitrogen sources and their concentrations together with the N/C ratio, the cations and their concentrations were determined in laboratory-scale batch bioreactors. Perturbation effects of the Phe synthesis pathway precursors PEP and E4P on the aromatic amino acid pathway were investigated. The mass flux balance based stoichiometric model for B.subtilis has been set up for metabolic flux analysis. The model considers 232 reaction fluxes, and 184 metabolites that are assumed to be in pseudo-steady state. The fluxes of the metabolic pathways through the central carbon pathways in the Phe fermentation process were calculated on the basis of the model using time profiles of glucose, dry cell, the product Phe, other amino acids, and organic acids. Metabolic flux analysis was conducted for the reference- and E4P perturbated- media. Results of the metabolic flux analysis revealed that induction by E4P influenced the pathway reactions via chorismate and prephanate towards Phe by increasing the flux values. Nevertheless, the reaction R96 catalysed by chorismate mutase has the lowest flux value among the preceding reactions of the pathway that reduces the proceeding reaction rates towards Phe. Thus, chorismate mutase (EC 5.4.99.5) is predicted to be the primary rate-limiting step among the Phe pathway reactions. In order to overcome the limitation of the reaction R96 and to increase the yield and selectivity in Phe production, within the genetic engineering research programme, aroK gene of BS1315 encoding chorismate mutase enzyme was cloned first onto the E.coli plasmid pUCI9, and then sub-cloned onto a multicopy Bacittus-E.coli shuttle vector pMK4 for developing recombinant B.subtilis carrying pMK4