Laktik asit bakterilerinde tür içi ve türler arası ayrımda 16S-ARDRA tekniğinin değerlendirilmesi

Abstract

Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Mikrobiyal Genetik laboratuvarımızdaki kültür koleksiyonunda mevcut bulunan ve daha önce fenotipik testler ve API kit kullanımı ile tanımlanmış olan Laktik Asit Bakterilerine ait 148 adet suşun türler arası/tür içi ayrımında 16S-ARDRA tekniğinin taksonomik potansiyelinin belirlenmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla çalışmada kullanmış olduğumuz LAB' nin genomik DNA'ları izole edilmiş ve daha sonraki aşamalarında kalıp DNA görevi görmüştür. 16S evrensel primer çitfi [pB (5'd TAACACATGCAAGTCGAACG 3') ve 1492R (5'd TACCTTGTTACGACTT 3') ] kullanılarak elde edilen 1458 bç. büyüklüğündeki PZR ürünü 7 farklı restriksiyon enzimi (HaeIII, HindIII, HinfI, MspI, PaeI, PstI ve TaqI) ile kesilmiştir. Farklı uzunluklara sahip restriksiyon enzim ürünlerin agaroz jel üzerindeki bant profilleri bilgisayar yazılım programına aktarılmıştır. Bantların arasındaki benzerlik ?Dice product moment correlation coefficient? ile ifade edilip % değerine dönüştürüldükten sonra UPGMA (aritmetik ortalama kullanarak ağırlıksız gruplama yöntemi) analizi ile kümeleme yapılmış ve tür/suş arasındaki genetik benzerlik dendogram olarak gösterilmiştir. Kümeleri birbirinden ayırt etmek için korelasyon katsayısı % 90 olarak belirlenmiştir. Kullanmış olduğumuz 7 farklı restriksiyon enzimine bağlı olarak türler arası/tür içi seviyede birbirleri ile oldukça yakın ilişkide bulunan LAB suşlarının ayrımında bu tekniğin ayrım gücü son derece zayıf bulunmuştur. Enterococcus suşlarının HinfI-16S ARDRA paternleri göz önünde bulundurulduğunda E. hirae, E. fecalis 135 ve E. fecalis 80 suşları sahip oldukları bant profillerine göre diğer Enterococcus türlerinden farklılıklar sergilemişlerdir. Enterococcus grubuna ait tür ve suşların ayrımında 16S rDNA PZR ürününün HindIII ile kesimi neticesinde elde edilen bant profili ile de E. hirae suşu diğer enterokoklardan ayrılmıştır. Lactococcus suşlarının HaeIII ve MspI-16S ARDRA paternleri göz önünde bulundurulduğunda Lc. lactis subsp. lactis W1, W2 ve W3 suşları diğer Lc. lactis subsp. lactis suşlarından ayrılmıştır. Bununla beraber, bu 7 enzimin kullanımı ile gerçekleştirilen 16S ARDRA tekniği Leuconostoc, Lactobacillus ve Pediococcus grubunda yer alan bakterilerin türler arası ve tür içi seviyesinde ayrımı için yeterli olmamıştır. Farklı restriksiyon enzimleri ya da çoklu enzim kombinasyonlarının denenmesi ile bu tekniğin türler arası ve tür içi seviyesinde ayrım sağlayabileceği düşünülmektedir.Anahtar Kelimeler: Laktik Asit Bakterileri (LAB), 16S-ARDRA, moleküler taksonomi

It is the the aim of this study to determine the taxonomic potential of 16S-ARDRA in discrimination (at the species and the intra-species level) of 148 strains of LAB that are present in Microbial Genetic Laborotory within the Biology Department of Science Faculty at Ankara University. The strains used were identified previously by phenotypic tests and by use of API kit. Genomic DNAs of LAB were isolated, used as template in amplification of 16S rRNA gene by use of 16S universal primers [pB (5?d TAACACATGCAAGTCGAACG 3?), 1492R (5?d TACCTTGTTACGACTT 3?)] and PCR products (1458bp long) were digested with use of 7 different restriction enzymes (HaeIII, HindIII, HinfI, MspI, PaeI, PstI ve TaqI). Restriction enzyme products of various lengths were analyzed on agarose gel as band profile/pattern. These band profiles were exported into the software program for further analysis. Calculation of similarities in the profiles of bands was based on Dice product-moment correlation coefficient (r) for 16S ARDRA. The UPGMA clustering algorithm was used to generate a dendogram. A coefficient of correlation of 90 % was selected to distinguish the clusters for 16S-ARDRA. Depending on the seven restriction enzymes used throughout the studies, the result of the study demonstrated the less discriminative power of these teqniques towards the differentiation of highly related LAB strains on species and strains levels. Wıth respect to discrimination of Enterococcus by use of HinfI-16S ARDRA band profiles, E. hirae, E. fecalis 135 and E. fecalis 80 strains showed band profile differences as compared to other Enterococcus species and strains. Besides, HindIII/16S-ARDRA profiles revealed discrimination of E. hirae from the rest of Enterococcus. In addition, as far as HaeIII ve MspI-16S ARDRA band profiles of Lactococcus strains are concerned, a good discrimination of Lc. lactis subsp. lactis W1, W2 and W3 from other Lactococcus strains was obtained. 16S ARDRA depending on the use of seven restriction enzymes did not achieve discrimination in between Pediococcus, Leuconostoc and Lactobacillus strains, neither at species nor at strain levels. This method may provide discrimination at species and/or intra-species level by use of different restriction enzymes or multiple enzymes combinations.Key Words: Lactic Acid Bacteria (LAB),16S-ARDRA, molecular taxonomy