Ayva polifenol oksidaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

ÖZET Bu çalışmada ayvadan {Cydonia Oblango) polifenol oksidaz enzimi izole edilmiş ve kısmen sallandırılarak enzimin karakterizasyonu yapılmıştır. Polifenol oksidaz enzimi (E.C. 1.10.3.1) gıdalarda mevcut renksiz polifenolleri kahverengi kinonlara dönüştürerek enzimatik kararmalara neden olmaktadır. Yerel pazarlardan alınantaze Eşme ayvaları polivinilpirolidon ve askorbik asit varlığında 0.2 M fosfat tamponunda blender ile homojenize edildi. Cam pamuğu ve tülbent yardımıyla membran artıklarından ayrıldı. Elde edilen ham ekstrakt (NH4)2S04 ile %67.5 doygunlukta çöktürüldü. Santrifîijlenerek ayrılan çökelek, 0.02M fosfat tamponu ile çözüldükten sonra denature proteinden arındırmak üzere santrifîijlenerek supernatant kısmı alındı. Supernatant çözeltisi 0.02 M fosfat tamponu 3 kez değiştirilmek üzere 36 saat dialize tabi tutuldu. Sallandırma basamaklarının herbirinde Lowry Metoduna göre protein tayini yapıldı. Ayrıca her fraksiyon için polifenol oksidaz aktivitesi tayini spektrofotometrik metod kullanılarak yapılmıştır. Substrat spesifitesi çalışılmış, enzim kateşol ve pirogallolu substrat olarak seçtiği belirlenmiştir. Optimum pH ve optimum sıcaklık çalışmaları yapılmış, optimum pH 8, optimum sıcaklık = 15°C olarak bulunmuştur. Yapılan inhibitor denemesinde tiyoasetamid, KCN, üre, EDTA, Na2S203, askorbik asit, sistein, sitrik asit, Na2HAs04.7H20 'in enzimi farklı oranlarda inhibe ettiği gözlenmiştir. Zamanın enzim aktivitesine etkisini belirlemek amacıyla substrat olarak kateşol kullanılarak 21 gün süreyle aktivite denemeleri yapılmıştır. Aynı substrat için polifenol oksidaz enzime ait K^ ve Vmax sabitleri Km = 3.31 x 10-3 ve Vmax = 0.153 olarak belirlenmiştir. Yapılan sıcaklık çalışması yardımıyla aktivasyon enerjisi -916.502 cal/mol olarak bulunmuştur.

SUMMARY In this study, polyphenol oxidase enzyme was isolated from quince (Cydonia Oblcmgo) and characterised after partiall purification. Polyphenol oxidase enzyme (EC. 1.1 0.3.1) oxidizes the colorless polyphenol to brown quinones and thus is responsible for the darkening of the sliced fruits and vegetables. Fresh quince obtained from local markets were homogenised a with a blender in 0.2 M phosphate buffer containing of polyvinylpyrrolidone (PVP) and ascorbic acid. Membranes were trapped on a fine batiste and glass cotton. The crude extract acquired this way was precipitated with (NH4)2S04 at 67.5% saturation point. After the sediment that separeted with centrifuge solved with 0.02M phosphate buffer, it was centrifuged again to clear from protein and supernatant was obtained. The supernatant solution have been subjected to dialysis for 36 hours after 0.02 M phosphate buffer were altered 3 times. In each purification stage, proteins were assayed by Lowry method and the determination of polypheol oxidase activity for each fraction were made by spectrophotometric method. Specification of substrate was evaluated and the enzyme was described as catechol and pyrogallol substrate. Specific charecterization studies of these enzyme yielded optimum pH of 8 and optimum temperature of 15°C. Enzyme inhibitor determination studies were performed and the following inhibitors were found to inhibit the enzyme at different rates : thioacetamide, potassium cyanide, urea, EDTA, sodiumthiosulphate, ascorbic acid, cycteine, citric acid, NaoHAsC^JHoO. In order to determine the effects of time over the activity of the enzyme, catechol was used as substrate and for 21 day period. Using catechol as substrate, the K^ and Vmax constants were determined as 3.31xl0-3 and 0.153 respectively. The temperature studies, displayed an activation energy of -916.502 cal/mol.