Domateste (Lycopersicon esculentum Mill. ) izole edilmiş mikrospor kültürü, ovaryum kültürü ve Solanum sisymbriifolium Lam. ile tozlama yöntemleri ile haploid embriyo oluşumunun uyartılması

Abstract

DOMATESTE (Lycopersicon esculentum Mill.) İZOLE EDİLMİŞ MDKROSPOR KÜLTÜRÜ, OVARYUM KÜLTÜRÜ VE Solunum sisymbrüfolium Lam. İLE TOZLAMA YÖNTEMLERİ İLE HAPLOİD EMBRİYO OLUŞUMUNUN UYARTILMASI Özet Domateste (Lycopersicon esculentum Mili.) izole edilmiş serbest mikrospor kültürü, in vitro ovaryum kültürü ve cinsler arası tozlama yöntemleriyle haploid embriyo ve bitki oluşumunun uyartımı denenmiştir. Tek çekirdekli gelişim safhasında bulunan mikrosporları içeren tomurcuklar in vitro şartlarda 0.3 M mannitol içeren ön kültür ortamında, 10 °C de 7 gün süreyle karanlıkta ön uygulamaya tabi tutulmuşlardır. Bu uygulama sonrasında izole edilerek, BAP'ın 0.5 mg/1 ve NAA'nın 0.5, 1.0 ve 1.5 mg/1 konsantrasyonu ve 2 ve 4 ml/1 Lactalbumin Hydrolysate içeren NLN (Lichter, 1981, 1982) kültür ortamlarında, simetrik çekirdek bölünmesi ve çok çekirdekli yapıların (proembriyolar) oluşumu uyartılmıştır. Lactalbumin Hydrolysate yerine Casein Hydrolysate' in denendiği ikinci bir denemede ise Falcon, Invictus ve Gökçe çeşitlerinden, 5 ve 10 g/I Casein Hydrolysate' in bulunduğu NLN (Lichter, 1981, 1982) + BAP 0.5 mg/1 + NAA 0.5 mg/1 kültür ortamlarında simetrik çekirdek bölünmesi ve çok çekirdekli yapıların oluşumu uyartılırken hiçbir ortam ve koşulda mikrosporlardan rejenerasyon gerçekleşmemiştir. In vitro ginogenesis çalışmasında altı farklı çeşite ait ovaryumlar, haploid uyartımı amacıyla önce mannitol içeren agarlı ön uygulama ortamında ve sonrasında Kinetin Ribozid'in 1.08 mg/1, BAP'ın 2.25 mg/1 ve IAA'nın 0.44 ve 0.88 mg/1 konsantrasyonlarını içeren x/ı MS (Murashige ve Skoog, 1962) kültür ortamlarında kültüre alınmışlardır. Kültüre alman ovaryumların ovaryum duvarından ya da diğer somatik dokudan kallus oluşumu meydana gelmemiş, aksine ovaryum duvarı kahverengileşmiş ve kuruyarak açılmıştır. Bu şekilde gözlenebilen ovullerin şişkin ve globuler bir görünüşte olduğu belirlenmiştir. İki basamaklı olarak düzenlenen çalışmada ovaryumlar 30. günde, o vu İlerde sporofıtik olarak gelişmiş olması muhtemel embriyo kesesi hücrelerinin rejenerasyonunu uyartmak üzere 2,4-D, NAA, Glycine, Proline ve Casein Hydrolysate'ı içeren NLN (Lichter, 1981, 1982) temel ortamında alt kültüre alınmışlardır. Kültür sonunda hiçbir ovaryumdan somatik ya da embriyo kesesi orijinli gelişim meydan gelmemiştir. Sporofıtik gelişime dönüşümün uyartı İma durumunun belirlenmesi amacıyla alt kültüre alımdan hemen önce fıkse edilen ovaryumlarda yapılan histolojik incelemelerde bütün çeşitlerde ve ortamlarda fiksasyon tarihinde bazı ovuller canlılıklarını korurken, embriyo kesesinin bulunduğu bölgede proembriyo olduğu düşünülebilecek çok çekirdekli yapıların bulunduğu gözlenmiştir. Diğer bazı ovullerde ise ovul kesit şekli köşeli bir görüntü vermiş ve zigotik embriyo aborsiyonunda olduğu gibi embriyo kesesinde kahverengi leşme gözlenmiştir. Bunların histolojik inceleme amacıyla fıksasyona alınma zamanında canlılıklarını yitirmiş oldukları düşünülmüştür. Haploid oluşumunun uyartımı potansiyelinin belirlenmesi amacıyla Lycopersicon esculentum (2n=2x=24) Solanum sisymbrüfolium (2n=2x=24) ile tuzlanmıştır. Polen tüpü gelişimi ve ovullere girişi Invictus, Sagit 146, Falcon, Gökçe, Elif, SC2121 çeşitlerinde gözlenmiş olmasına karşılık ovuller sadece Invictus ve Sagit 146 meyvelerinde gelişmiştir. Kültüre alınan ovullerden embriyolar gelişerek çimlenmiş ve in vitro gelişen beş bitkide her bir kök ucu ve bitki için sabit kalmak üzere 24, 25, ve 26 kromozom olduğu belirlenmiştir.

INDUCTION OF HAPLOID EMBRYO DEVELOPMENT VIA IN VITRO ISOLATED MICROSPORE AND OVARY CULTURE TECHNIQUES AND WIDE HYBRIDIZATION USING Solan urn sisymbriifolium Lam. IN TOMATO {Lycopersicon esculentum Mill.) Summary Induction of haploid embryo and plantlet development was intended using in vitro isolated microspore and ovary culture techniques and intergeneric pollinations in tomato {Lycopersicon esculentum Mill.). For stress pretreatment, anthers in intact flower buds, of the cv. Fantastic, containing uninucleate microspores were incubated in a pre-culture medium containing 0.3 M mannitol, in darkness, at 10 °C for seven days. After the pretreatment, isolated microspores cultured in NLN (Lichter, 1981, 1982) basic medium supplemented with BAP at 0.5 mg/1, NAA at 0.5, 1.0, 1.5 mg/1, Lactalbumin Hydrolysate at 2 - 4 ml/1 were induced to divide symmetrically and develop further to form multi nucleate structures (proembryos). When Lactalbumin Hydrolysate was replaced with Casein Hydrolysate at 5 and 10 g/1 levels, isolated microspores of the cv.'s Falcon, Invictus and Gökçe were induced to divide symmetrically and form multinucleated structures in NLN (Lichter, 1981, 1982) + BAP 0.5 mg/1 + NAA 0.5 mg/1. Regeneration was not induced under the experimental conditions. Ovaries of six different cultivars were cultured on mannitol containing pretreatment medium at 10 °C for seven days and were transferred to half strength MS medium (Murashige ve Skoog, 1962) containing Kinetin Ribozide at 1.08 mg/ and BAP at 0.5 mg/1 and IAA at 0.44 ve 0.88 mg/1 to induce switch to sporophytic development. Somatic callus, either from ovary wall or other somatic tissues, did not develop and on the contrary ovary wall turned brown and dried exposing ovules, which when observed appeared globular in shape, maintainig viability. Following 30 days of culture in the first step media, ovaries carrying female gametophytes which was presumed to have been triggered to develop sporophytically, were transferred to second step media, containing 2,4-D, NAA, Glycine, Proline and Casein Hydrolysate in the NLN medium (Lichter, 1981, 1982), to induce further regenerative development. Ovaries were fixed and sectioned in order to determine histologically if the sporophytic development was triggered in the female gametophyte. Ovules of all the varieties, on all the media tested, displayed two distinct development in the sections, one of which is circular, containing multicellular structures at the location of the embryo sac and was considered to have maintained viability at the time of fixation and and appearence of the others' was rectangular of which embryo sacs contained brown cells appearing similar to aborted zygotic embryos and these type of ovules were considered to have lost viability at the time of ovary fixation. Lycopersicon esculentum Mill. (2n=2x=24) was pollinated with Solanum siymbriifolium Lam. (2n=2x=24) in order to determine the haploid production potentials of the cross combination. In situ pollen tube development and its entry into ovules was observed for the cultivars Invictus, Sagit 146, Falcon, Gökçe, Elif and SC2121. Ovule development was obtained only in two cultivars and when the ovules were cultured embryos developed and five plants obtained displaying 24, 25, and 26 chromosomes, numbers being stable for each root tip and plant examined. II