Tosil-fenilalanin klorometil keton ve dietil pirokarbonatın insan serum psödokolinesterazı üzerine etkisi

Abstract

ÖZET Çalışmada, satın alınan insan serum psödokolinesterazı (asılkolin asilhidrolaz E.C. 3.1.1.8) tekrar Sepharose CL-6B kolonundan geçirilerek saflaştırıldı ve 10 mM MOPS tamponu (pH: 7.4) içinde dondurularak saklandı. TPCK ile yapılan modifikasyon çalışmasında, histidine yönelimli bir modifaktör olmasına rağmen, TPCK'nın insan serum PKE'sinin aktif merkezinde katalizden sorumlu histidim` modifiye etmediği gözlenmiştir. TPCK'mn enzimin hidrofobik bağlanma bölgesine bağlanmak için substratla yarışarak, tersinir olarak inaktivasyonu sağladığı düşünülmektedir. Yapı lan deneylerden, TPCK inaktivasyonunun hiperbolik karışık-tipte (mixed- typed) inhibisyon olduğu sonucuna varıldı. Artan BTK derişimi erinde (0.25-1 mM) ve ilave olarak 50, 100, 150, 200 uM TPCK içeren aktivite ölçüm ortamlarında saptanan ilk hızlarla Lineweaver-Burk doğruları çizilerek 1^= 0.14 mM, Vm: 109 yM/dak/mg enzim, a: 10.8, 3: 0.26 ve K-/ : 0.016 mM olarak bulundu. DPC ile yapılan modifikasyon çalışmasında ise, insan serum PKE'si nin DPC tarafından zamana bağımlı (time-dependent) bir şekilde inhibe edil' diği görüldü. Yapılan koruma deneyinde, substrat derişimi 50 mM'a çıkarılmasına rağmen enzim, inaktivasyona karşı tam olarak korunamadı. Bu sonuç, aktif merkez dışındaki histidinlerin modifiye edildiğini ve aktif merkezin fonksiyonu için bu histidinlerin önemli rolleri bulunduğunu göstermektedir.

SUMMARY In this study, commercially available human serum pseudo- cholinesterase (acylcholine acylhydrolase E.C. 3.1.1.8) has been further purified by using Sepharose CL-6B column and kept frozen in 10 mM MOPS buffer (pH: 7.4). In the modification studies, it has been observed that, histidine-specific reagent TPCK could not modify the histidine residue found at the active site and responsible of the catalysis of human serum pseudocholinesterase. It is thought that TPCK, competing with substrate for the hydrophobic binding site, inactivates the enzyme reversibly. From the kinetic studies, it was concluded that TPCK inactivation is hyperbolic mixed-typed inhibition. Initial velocities have been measured in the increasing concentrations of substrate (0.25-1 mM) and additionally in the presence of 50, 100, 150, 200 uM TPCK and from the Lineweaver - Burk plots kinetic parameters have been calculated as : Km : 0.14 mM, Vm : 109 yM/min/mg enzyme, a : 10.8, g : 0.26 and K^ : 0.016 mM. On the other hand, in the modification studies with DPC, it has been observed that, inhibition of human serum pseudo cholinesterase by DPC is time-dependent. In the protection studies, activity of the enzyme has not been fully protected from the inhibition effect of DPC even at 50 mM substrate concentration. The results indicate that, DPC modifies the functional histidine residues found probably near the active site.